羅非魚鱗膠原肽亞鐵螯合物制備工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)表征

唐順博 涂宗財,3 沙小梅 張 耀 張 露

(1. 江西師范大學國家淡水魚加工技術研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022； 2. 江西師范大學江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022； 3. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

鐵為人體必需元素，在維持正常造血功能和增強免疫功能等方面起到巨大作用[1]。世界上約有25%的人患有貧血，其中一半是缺鐵造成的，口服補鐵劑是治療缺鐵性貧血的重要方法之一，但傳統(tǒng)硫酸亞鐵復合劑可能會導致患者腸胃不適[2]。研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸鐵螯合物比傳統(tǒng)硫酸亞鐵復合劑具有更好的補血效果[3]，多肽亞鐵螯合物作為一種新型補鐵劑，可通過肽的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)直接被人體吸收，并且對人體刺激較小，有希望用于一些特殊人群[4-5]。

明膠是一種多功能性的生物大分子，普遍用于食品、醫(yī)藥及化工領域[6-8]。與傳統(tǒng)明膠相比，魚明膠具有來源廣，價格低，營養(yǎng)價值高等特點。隨著近年水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，魚類加工副產(chǎn)物如魚鱗、魚頭、魚內(nèi)臟等資源被大量浪費，充分利用加工副產(chǎn)物能大大提高魚類的綜合價值[9]。沙小梅等[10]從鳙魚魚鱗中提取魚鱗明膠并研究了提取過程中pH值對鳙魚魚鱗明膠性質(zhì)的影響；Sinthusamran等[11]研究了不同提取溫度對鱸魚魚皮明膠性質(zhì)的影響。羅非魚別稱非洲鯽魚，肉質(zhì)鮮嫩，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，是中國魚類養(yǎng)殖中的重要品種[12]，賈杏歌等[13]研究了不同濃度戊二醛對羅非魚鱗膠原蛋白膜機械性和抗水性的影響；李瑞杰等[14]比較了不同酶解物的鈣離子螯合能力和螯合物的抗氧化活性。劉永等[15]曾對羅非魚鱗膠原蛋白肽鐵螯合物的制備工藝進行了優(yōu)化，但未對螯合物結(jié)構(gòu)進行探究。

研究擬以羅非魚鱗膠原肽為原料制備多肽亞鐵螯合物，并對多肽亞鐵螯合物的最佳制備工藝及其結(jié)構(gòu)進行探索，以期為羅非魚魚鱗的精深加工及高值化利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚鱗明膠：蘇州吉利鼎海洋生物科技有限公司；

堿性蛋白酶：酶活力為8.68×107U/g，諾維信酶制劑公司；

乙腈、三氟乙酸：色譜純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

細胞色素C、抑肽酶、L-氧化型谷胱甘肽、羥脯氨酸：色譜純，北京索萊寶科技有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SevenCompact臺式pH計：S220型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

冷凍干燥機：SR-AON-50型，上海舍巖儀器有限公司；

HSM高效液相色譜：D-2000型，日本Hitachi公司；

酶標儀：Synergy H1型，美國Bio Tek公司；

氨基酸分析儀：L-8900型，日本Hitachi公司；

智能型傅立葉變換紅外光譜儀：Nicolet5700型，美國熱電尼高力公司；

掃描電鏡：S-3400N型，日本Hitachi公司；

X射線衍射儀：D8 ADVANCE型，德國BRUKER公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚鱗多肽的制備 酶解方法參考文獻[16]修改如下：取魚鱗明膠加蒸餾水配成濃度為5%的明膠溶液，置于50 ℃恒溫水浴鍋中保溫15 min，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8，加入明膠質(zhì)量比為1%的堿性蛋白酶水浴30 min，再次調(diào)節(jié)pH至8，水解4.5 h，水解結(jié)束后立即沸水浴10 min滅活，冷卻，4 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)冷凍干燥后存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 多肽分子量測定 按照GB 31645—2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》對多肽分子量進行測定。取1.3.1中多肽粉配制成1 mg/mL的溶液，過0.22 μm水系濾膜后，使用高效液相色譜儀進行分析。以細胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)和羥脯氨酸(131.13 Da)為標準品繪制相對分子質(zhì)量校正曲線。色譜條件：色譜柱型號為XBridge BEH 125? SEC(3.5 μm，7.8 mm×300 mm)；流動相比例為V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=40∶60∶0.05；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.3 多肽亞鐵螯合物制備工藝優(yōu)化

(1) 亞鐵螯合物的制備流程：

多肽→加入一定比例水→加入抗氧化劑(抗壞血酸)→調(diào)節(jié)pH值→按比例加入鐵鹽→進行螯合反應→加入無水乙醇沉淀→離心得到沉淀→冷凍干燥[17]

(2) 單因素試驗：由于亞鐵螯合受pH、多肽濃度及多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比影響較大[18]，因此試驗固定反應溫度為25 ℃，反應時間為40 min，pH為5.0，多肽濃度為3%，多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1，依次對pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)，多肽濃度(1%，2%，3%，4%，5%)，多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比(1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)進行單因素試驗，以螯合率和螯合物得率為指標，探討單因素對螯合反應的影響。

(3) 響應面試驗設計：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以pH值、多肽與鐵鹽質(zhì)量比和多肽液濃度為影響因素，設計三因素三水平響應面試驗，以多肽螯合物得率為評價指標，探索螯合物的最佳制備工藝。

1.3.4 評價指標的測定 采用鄰菲羅啉比色法[17]評價肽—鐵螯合體系中亞鐵離子的含量、鐵螯合率和螯合物得率。

(1) 鐵離子含量：

(1)

式中：

F——體系鐵離子含量，mg/kg；

C——從標準曲線獲得溶液相應的鐵含量，μg；

M——稱取樣品的質(zhì)量，g；

V1——測定所取的溶液體積，mL；

V2——樣品處理后的定容體積，mL。

(2) 鐵螯合率：

(2)

式中：

D——鐵螯合率，%；

m1——螯合物中鐵的含量，mg；

m2——加入鐵的含量，mg。

(3) 螯合物得率：

(3)

式中：

Y——螯合物得率，%；

M1——生成物總質(zhì)量，g；

M2——加入反應體系的總質(zhì)量，g。

1.3.5 氨基酸組成分析 參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸自動分析儀對樣品中氨基酸的含量進行測定。

1.3.6 多肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征

(1) 掃描電鏡分析：取少量樣品，均勻涂在樣品盤的導電膠上進行噴金處理，之后采用S-3400N型掃描電子顯微鏡進行掃描，對其表觀形貌進行分析。

(2) 紅外光譜分析：采用Nicolet 5700型紅外光譜儀測定多肽與多肽亞鐵螯合物的紅外光譜，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

(3) X衍射分析：將樣品研磨均勻后，采用Bruker D8 X-射線衍射儀進行分析測定，分析條件為：Cu靶，管電流40 mA，掃描速度10°/min，掃描角度為5°～80°。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽分子量分布

通過對標品出峰時間與標品分子量進行線性擬合，得到分子量標品標準方程為Y=6.855 16-0.249 9X(R2=0.997)，由圖1可知，膠原多肽中主要含有4個組分，經(jīng)計算各組分平均分子量分別為7 479，5 450，3 030，889 Da，符合GB 31645—2018標準對多肽的定義。

圖1 膠原多肽分子量分布

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2(a)可知，當固定多肽液濃度為3%，多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1時，螯合率和螯合物得率先升高，在pH為5時達到最大值，隨后又減小，表明反應體系在弱酸或中性時，溶液中的OH-會參與Fe2+的反應，不利于螯合反應的進行[19]；由圖2(b)可知，固定pH為5，多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1時，螯合率先增大后減小，在多肽液濃度為3%時，螯合率和螯合物得率最高，這是因為多肽濃度增大，在水中溶解性變小，參與反應的多肽更少；由圖2(c)可知，當固定多肽濃度為3%，pH為5時，螯合率隨亞鐵鹽質(zhì)量比的增大而減小，螯合物得率先增大后減小，當質(zhì)量比為3∶1時達到最大，可能是由于多肽與亞鐵離子的結(jié)合位點有限，當結(jié)合數(shù)目達到最大時，不再發(fā)生反應，不能生成螯合物[20]。

圖2 pH、多肽濃度和多肽與鐵鹽質(zhì)量比對螯合反應的影響

2.3 響應面優(yōu)化分析

2.3.1 響應面試驗設計及結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH、多肽濃度、肽鐵鹽質(zhì)量比三因素(見表1)，利用Box-Behnken中心組合原理設計三因素三水平的響應面試驗，試驗方案與結(jié)果見表2。

表1 響應面因素及水平表

用Desgin-Exper 8.0軟件對表2的試驗結(jié)果進行分析，建立螯合物得率(Y)的二次響應面回歸模型為：

表2 響應面試驗方案與結(jié)果

Y=1.15A+0.75B+0.80C-0.05AB+0.28AC-0.89BC-2.00A2-3.44B2-2.12C2+65.83。

(4)

根據(jù)表3中方差結(jié)果分析，該二次模型P值<0.000 1表明極顯著，相關系數(shù)R2為0.979 9，表明預測值和實測值之間有很高的相關性，RAdj2為0.954 1，表明此模型能解釋95.41%的響應值變化，因此該模型可以較好地描述pH值、多肽液濃度和多肽與鐵鹽質(zhì)量比對螯合反應影響的變化規(guī)律。

回歸方程的各項方差分析結(jié)果表明，A、B、C、A2、B2和C2對螯合物得率的影響極顯著(P<0.01)，BC相互作用對螯合物得率的影響顯著(P<0.05)，而AB、AC的相互作用對螯合物得率的影響不顯著(P>0.05)。由F值可知，各因素對螯合物得率的影響次序：pH>肽鐵質(zhì)量比>多肽濃度。剔除不顯著項AB、AC后對方程進行優(yōu)化，得優(yōu)化后的方程為：

Y=1.15A+0.75B+0.80C-0.89BC-2.00A2-3.44B2-2.12C2+65.83。

(5)

由圖3可知，因素B和C之間的相互作用等高線圖呈橢圓形，表明多肽濃度與肽鐵質(zhì)量比之間具有顯著的相互作用[21]，與表3結(jié)果一致。

圖3 多肽濃度與肽鐵鹽質(zhì)量比的交互作用對螯合物得率影響的響應面圖

表3 響應面二次模型方差分析?

2.3.2 最優(yōu)解的驗證 利用Design-Expert 8.0軟件計算得到肽鐵螯合物最佳工藝條件為pH 5.29，多肽濃度3.09%，多肽與鐵質(zhì)量比3.17∶1.00，預測螯合物得率為66.10%?？紤]到實際操作，最佳制備工藝確定為pH 5.30，多肽濃度3.00%，多肽與鐵質(zhì)量比為3.20∶1.00，在此條件下進行3次重復驗證實驗，螯合率平均值為82%，肽鐵螯合物得率平均值為65.43%，與最佳工藝條件螯合物得率66.10%無顯著性差異(P>0.05)，說明此模型可用于反應多肽螯合鐵的變化規(guī)律。

2.4 氨基酸組成成分分析

由表4可知，膠原多肽中Gly含量最高，Glu、Pro、Ala和Asp的含量也相對較高，符合膠原蛋白氨基酸組成特征[22]，結(jié)合圖1，多肽分子量分布在800～8 000 Da，因此可認為經(jīng)酶解后凍干所得粉末為膠原多肽。Glu、Gly、Lys、His和Arg等氨基酸被認為與金屬離子螯合活性密切相關[23-24]，從表4可知，該5種氨基酸在多肽中大量存在，經(jīng)螯合后，其在螯合物中的含量大量增加，與Lee等[25]的研究結(jié)果相符。

表4 多肽與螯合物的氨基酸組成

2.5 螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 掃描電鏡分析 由圖4可知，多肽表面光滑并有裂紋，可能是在真空干燥過程中失水導致，而螯合物是主體成球狀的團狀交織結(jié)構(gòu)，表面有顆粒附著于球體上，與汪婧瑜等[17]結(jié)果類似。

圖4 多肽與螯合物的掃描電鏡圖

2.5.2 紅外光譜分析 由圖5可知，發(fā)生螯合反應后，多肽和肽鐵螯合物的特征吸收峰發(fā)生了明顯的變化。螯合后，多肽的—NH2吸收峰由3 380.60 cm-1移動到3 370.97 cm-1，在1 542.77 cm-1處—NH2的吸收峰移動到1 546.63 cm-1，多肽的—COO—吸收峰由1 400.67 cm-1移動到1 409.71 cm-1，另外多肽的C—H吸收峰由于伸縮振動由1 455.99 cm-1移動到1 468.64 cm-1，以上結(jié)果表明多肽中—NH2、—COO—與C—H與亞鐵鹽發(fā)生反應生成了多肽亞鐵螯合物。

圖5 多肽與螯合物的紅外光譜圖

2.5.3 亞鐵螯合物的X衍射分析 由圖6可知，魚鱗膠原肽在2θ=20°左右處出現(xiàn)強衍射峰，與劉靜[26]所測圖譜類似，在與亞鐵離子螯合后，多肽螯合物在20°左右的衍射峰減弱，并且向大掠射角偏移，其他地方未出現(xiàn)衍射峰，屬于無規(guī)則的非晶體結(jié)構(gòu)，表明亞鐵離子與多肽以配位鍵形式結(jié)合。

圖6 多肽和螯合物的X衍射圖譜

3 結(jié)論

以魚鱗膠原肽為原料，以螯合物得率和螯合率為指標，采用單因素試驗及響應面法優(yōu)化得出了多肽亞鐵螯合物的最佳制備工藝為pH 5.30，多肽濃度3.00%，多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比3.2∶1.0，在此條件下螯合率為82%，螯合物得率為65.43%。氨基酸分析表明Glu、Gly、Lys、His和Arg等氨基酸在螯合反應中起到重要作用。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)多肽與螯合物表觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，由表面光滑變?yōu)榍蛐蛨F狀結(jié)構(gòu)；紅外光譜表明膠原多肽中的—NH2、—COO—以及C—H與亞鐵鹽發(fā)生了反應；X衍射圖譜分析發(fā)現(xiàn)亞鐵離子與多肽以配位鍵的形式結(jié)合，證實多肽與亞鐵鹽發(fā)生反應生成了螯合物。以上研究結(jié)果表明，魚鱗膠原肽可作為新型補鐵劑載體材料，擴寬了補鐵劑材料的來源，同時為魚類副產(chǎn)物中魚鱗的精加工提供了思路，有利于促進魚鱗的高值化利用。后續(xù)將采用體外和體內(nèi)模型研究羅非魚鱗膠原肽亞鐵螯合物的消化穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性，以及促進鐵吸收的效果。