制造過(guò)程對(duì)可溶性大豆多糖結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物起泡性的影響

張 權(quán) 陳 潔 曾茂茂 何志勇

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

可溶性大豆多糖(soluble soybean polysaccharides，SSPS)是從大豆子葉中提取出來(lái)的一種陰離子多糖[1]。工業(yè)上一般從脫油、除蛋白后的豆粕中提取SSPS(其含量占豆粕的5%左右)，從而實(shí)現(xiàn)大豆加工副產(chǎn)物的高效再利用。目前工業(yè)上存在多種提取SSPS的方法，包括酸法提取[2]、堿法提取、酶法提取[3]和物理超聲法提取[4]等，而不同方法提取的SSPS性質(zhì)存在著十分顯著的差異。

SSPS的結(jié)構(gòu)與果膠相似，果膠由半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖組成的主鏈以及半乳聚糖和阿拉伯聚糖組成的支鏈構(gòu)成，與果膠相比，SSPS的主鏈相對(duì)較短，而側(cè)鏈較長(zhǎng)[5-6]。SSPS具有多種功能特性，包括在酸性條件下穩(wěn)定蛋白的能力、乳化性、起泡性、成膜性和抗氧化性等性質(zhì)[7-8]。迄今為止，SSPS在酸性條件下穩(wěn)定蛋白能力的研究相對(duì)比較多，包括SSPS的濃度[9]、酯化度[10]、其與果膠的復(fù)配作用以及與其他多糖的協(xié)同作用[11]等。由于SSPS具有很低的黏度，使用在酸性含蛋白飲料中會(huì)帶來(lái)清爽的口感，這種特殊性質(zhì)使SSPS在酸性乳飲料中得以廣泛應(yīng)用[12]。

前人[13]研究結(jié)果也顯示，SSPS具有良好的表面活性，濃度為4%時(shí)其乳化能力甚至高于同濃度的阿拉伯膠。一般認(rèn)為，SSPS的表面活性主要來(lái)自于其結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)，SSPS之所以具有良好的乳化性，是由于SSPS結(jié)構(gòu)中的疏水多肽鏈能像錨一樣吸附在油滴表面，親水的多糖結(jié)構(gòu)鋪展在油滴表面形成帶電的吸附層從而防止油滴互相聚集[10]。然而影響SSPS的表面活性的因素，相對(duì)于其在酸性條件下穩(wěn)定蛋白的能力而言，相對(duì)研究得較少，尤其是SSPS的單糖組成、主鏈中的蛋白質(zhì)含量、分子量、分子量分布以及酯化度等結(jié)構(gòu)要素對(duì)于其表面活性的影響研究甚少。

目前，含氣泡的蘇打飲料或乳酸菌蛋白飲料逐漸興起，而SSPS由于兼具良好的起泡性和較低的黏度，極具應(yīng)用潛力[14]。作為一個(gè)有效的起泡劑，其結(jié)構(gòu)應(yīng)滿足下列基本要求：具有合適的親水親油結(jié)構(gòu)；能快速吸附到氣—水界面；吸附到界面的蛋白質(zhì)分子可以相互作用形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度和良好黏彈性的界面膜[15]。從SSPS的結(jié)構(gòu)分析，影響其表面活性的結(jié)構(gòu)特征主要包括分子量、酯化度以及SSPS中的蛋白含量。試驗(yàn)旨在通過(guò)控制酸水解、堿性脫酯和蛋白酶解條件獲得不同分子量、酯化度和蛋白含量的SSPS，并同步測(cè)定產(chǎn)物的起泡性，從而探究加工對(duì)于SSPS的結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)物起泡性的影響，進(jìn)而為工業(yè)生產(chǎn)出高起泡性的SSPS提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆纖維：大豆纖維的蛋白含量19.17%，總膳食纖維含量60%，水分含量7.85%，灰分2.44%，平頂山金晶生物科技股份有限公司；

右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品套裝：5.25，13.05，64.65，135.35，300.60，2 000.00 kDa，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

鹽酸、氫氧化鈉、95%乙醇：分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用水：去離子水(自制)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)：UV-5300PC型，上海元析儀器有限公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：WATERS 2695型，美國(guó)Waters公司；

凝膠色譜柱：TSK-gel G5000PWXL型，日本TOSOH公司；

高效液相色譜儀：WATERS 600型，美國(guó)Waters公司；

自動(dòng)凱氏定氮儀：KDN-103F型，上海纖檢儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：SB-5200型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

冷凍離心機(jī)：3K15型，德國(guó)Sigma公司；

恒溫干燥箱：HY300型，上海一恒科技有限公司；

振蕩水浴鍋：SHZ-82型，金壇市新航儀器廠；

實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電子分析天平：AL104型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

數(shù)字式ULTRA TURRAX均質(zhì)器：T18型，德國(guó)IKA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸水解制備不同分子量SSPS樣品 在朱昌玲等[16]酸提取方法的基礎(chǔ)上加以修改制備不同分子量的SSPS。將大豆纖維與去離子水以1∶25 (g/g)比例混合，混合液pH調(diào)節(jié)至4.0，并進(jìn)行不同程度的熱處理(100 ℃持續(xù)2.5 h；120 ℃持續(xù)2.5 h；135 ℃持續(xù)1.5 h)以獲得高、中、低分子量的可溶性大豆多糖(SSPS)，分別被命名為M1(高分子量SSPS)、M2(中分子量SSPS)、M3(低分子量SSPS)。將反應(yīng)后的混合液離心(5 400×g) 10 min，收集上清液，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/10，將所得的濃縮液與3倍體積95%的乙醇混合，5 400×g離心10 min，獲得的沉淀物在60 ℃的烘箱中干燥24 h，粉碎，過(guò)100目篩網(wǎng)，獲得不同分子量的SSPS粉末。

1.2.2 堿脫酯制備不同酯化度SSPS樣品 將1.2.1中制備的低分子量SSPS溶于去離子中，分別進(jìn)行不同程度的堿性脫酯處理(pH 12.0、90 ℃，2 h； pH 12.5、90 ℃，2.5 h)以獲得中酯化度(DE)和低酯化度(DE)的SSPS。將未進(jìn)行堿性脫酯處理的SSPS定義為高酯化度SSPS，并命名為M3D1(低分子量高酯化度)，將堿性脫酯處理的樣品分別命名為M3D2(低分子量中酯化度)、M3D3(低分子量低酯化度)。將反應(yīng)后的混合液離心(5 400×g) 10 min，收集上清液，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/10，將所得的濃縮液與3倍體積95%的乙醇混合，調(diào)節(jié)pH至4.0，5 400×g離心10 min，獲得的沉淀物在60 ℃的烘箱中干燥24 h，粉碎，過(guò)100目篩網(wǎng)，獲得低分子量不同酯化度的SSPS粉末。

1.2.3 蛋白酶處理制造不同蛋白質(zhì)含量SSPS樣品 將1.2.1中制備的低分子量SSPS溶于去離子水中，添加3%的木瓜蛋白酶，在pH 6.0、50 ℃下分別酶解1，2 h[17]。將未進(jìn)行酶解處理的SSPS定義為高蛋白含量的SSPS，并命名為M3P1 (低分子量高蛋白含量SSPS)，將酶解處理的樣品分別命名為M3P2 (低分子量中蛋白含量SSPS)、M3P3 (低分子量低蛋白含量SSPS)。將反應(yīng)后的混合液離心(5 400×g)10 min，收集上清液，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/10，將所得的濃縮液用3倍體積95%的乙醇混合，調(diào)節(jié)pH至4.0，將混合液離心(5 400×g) 10 min，獲得的沉淀物在60 ℃的烘箱中干燥24 h，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩網(wǎng)，獲得低分子量不同蛋白含量的SSPS粉末。

1.2.4 SSPS分子量的測(cè)定 使用高效液相色譜系統(tǒng)、2414示差檢測(cè)器、TSK-gel G5000PWXL 凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm，TSK)測(cè)定SSPS的分子量。流動(dòng)相為pH 6.8、13.097 g/L磷酸鹽緩沖液，流速0.6 mL/min。取0.1 g SSPS溶解于10 mL磷酸鹽緩沖液中，將SSPS溶液過(guò)0.45 μm水系濾膜然后注入HPLC色譜系統(tǒng)。使用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(5.25，13.05，64.65，135.35，300.60，2 000.00 kDa)繪制多糖分子量(Mw)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為：lgMw=-0.268 5tR+9.271 4，R2=0.997 3，根據(jù)曲線方程計(jì)算SSPS重均分子量。

1.2.5 SSPS酯化度的測(cè)定 參照Xiong等[10]的滴定法并稍加改進(jìn)。將SSPS(500 mg)在100 mL乙醇—HCl混合物(在100 mL 70%乙醇中的5 mL 437.5 g/L HCl)中攪拌10 min，再通過(guò)濾紙和玻璃漏斗過(guò)濾。收集的SSPS用上述乙醇—HCl混合物洗滌6次(每次20 mL)，再用60%乙醇溶液洗滌，直到濾液中無(wú)硝酸銀離子為止。將SSPS在60 ℃下干燥24 h。該處理消除了游離糖和鹽，將SSPS轉(zhuǎn)化為游離酸形式。將干燥的樣品(200 mg)用0.8 mL乙醇潤(rùn)濕，溶解在40 mL無(wú)二氧化碳的蒸餾水中，并使用酚酞作為指示劑通過(guò)4 g/L氫氧化鈉(NaOH)溶液滴定。NaOH的使用體積記錄為V1。將20 g/L NaOH添加到滴定的樣品溶液中進(jìn)行脫甲基處理。15 min后，將18.2 g/L脫甲基 HCl(與脫甲基所用20 g/L NaOH的體積相同)添加到滴定的樣品溶液中。使用4 g/L NaOH滴定樣品，并將使用的體積記錄為V2。按式(1)計(jì)算酯化度。

(1)

式中：

DE——酯化度，%；

V1——第1次滴定NaOH消耗的體積，mL；

V2——第2次滴定NaOH消耗的體積，mL。

1.2.6 SSPS蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 凱氏定氮法[18]。

1.2.7 SSPS單糖組成的測(cè)定 將500 mg SSPS樣品和8 mL 218.8 g/L鹽酸置于密閉管中，于120 ℃水解22 h。水解樣品用400 g/L NaOH中和，并用蒸餾水稀釋至25 mL。過(guò)濾后，將濾液以12 600×g離心30 min。將上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取10 μL上高效液相色譜儀測(cè)定單糖組成。

1.2.8 SSPS起泡性能的測(cè)定 根據(jù)Kunarayakul等[19]的方法加以修改。將10 mL的1 g/100 mL SSPS溶液轉(zhuǎn)移到50 mL塑料量筒中，用勻漿器以17 500 r/min的速度攪打2 min。分別按式(2)、(3)計(jì)算泡沫膨脹和泡沫穩(wěn)定性(FS)。

(2)

(3)

式中：

FE——泡沫膨脹率，%；

FS——泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——液體的初始體積，mL；

V1——?jiǎng)倲嚧蛲昱菽捏w積，mL；

V2——靜置30 min后的泡沫體積，mL。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 除單糖組成和分子量數(shù)據(jù)外，其余數(shù)據(jù)均測(cè)試3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。方差分析使用置信區(qū)間為95%的最小顯著性差異檢驗(yàn)來(lái)比較均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸水解過(guò)程熱處理程度對(duì)于SSPS結(jié)構(gòu)性質(zhì)和起泡性的影響

如表1所示，隨著SSPS提取過(guò)程熱處理程度的加重，產(chǎn)物分子量不斷下降，從556 kDa降低至217 kDa，SSPS結(jié)構(gòu)中鼠李糖含量逐漸降低，而阿拉伯糖和半乳糖含量并未發(fā)生改變。Nakamura等[20]曾報(bào)道，SSPS主要由鼠李糖和半乳糖醛酸構(gòu)成其主鏈，由半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成其側(cè)鏈。因此可推測(cè)，隨著酸水解程度越來(lái)越劇烈，SSPS分子量逐漸降低，其主鏈結(jié)構(gòu)可能被逐漸破壞。從表1還可以看出，隨著酸水解過(guò)程熱處理程度的加重，產(chǎn)物SSPS的酯化度和蛋白含量并未發(fā)生顯著改變。該結(jié)果提示，SSPS中的蛋白結(jié)構(gòu)可能主要存在于主鏈結(jié)構(gòu)上。

表1 不同酸水解條件下SSPS的重均分子量、酯化度、蛋白含量和單糖組成

如圖1所示，隨著SSPS分子量的逐漸降低，其泡沫膨脹率逐漸增大，而泡沫穩(wěn)定性逐漸減小。分子量的降低有助于提高SSPS的起泡能力，這是因?yàn)樾》肿恿康腟SPS能更快地移動(dòng)到氣—水界面，進(jìn)而更快地產(chǎn)生泡沫。而分子量降低使得SSPS的泡沫穩(wěn)定性下降，可能是由SSPS在氣—水界面的界面膜黏彈性下降導(dǎo)致。Chivero等[21]研究表明，相對(duì)分子量的增大會(huì)使SSPS溶液的黏度增加。另有研究[22]表明，茶葉多糖隨溶液黏度的增大，液膜的表面黏彈性提高，多糖溶液的泡沫穩(wěn)定性也越好。

字母不同表示不同樣品之間存在顯著差異(P<0.05)

2.2 堿脫酯工藝對(duì)SSPS的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和起泡性的影響

如表2所示，隨著pH的提高和脫酯時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物SSPS的甲酯化度不斷降低，而SSPS的重均分子量和單糖組成并未發(fā)生明顯改變，說(shuō)明堿脫酯過(guò)程對(duì)SSPS的主鏈和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)影響不顯著。隨著酯化度的降低，SSPS的蛋白含量逐漸降低。另外隨著酯化度的降低，反應(yīng)液顏色顯著增加，說(shuō)明堿脫酯過(guò)程使SSPS發(fā)生了劇烈的美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白含量降低。An等[23]的研究也表明堿脫酯過(guò)程會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的美拉德反應(yīng)。

表2 不同堿處理?xiàng)l件下SSPS的重均分子量、酯化度、蛋白含量和單糖組成?

如圖2所示，隨著酯化度的降低，SSPS的泡沫膨脹率和泡沫穩(wěn)定性均逐漸降低。有研究[24]稱，SSPS的起泡性能主要由兩親性蛋白質(zhì)成分決定，當(dāng)SSPS的蛋白質(zhì)含量降低到一定水平時(shí)，其起泡能力會(huì)大大降低。

字母不同表示不同樣品之間存在顯著差異(P<0.05)

2.3 蛋白酶水解對(duì)產(chǎn)物SSPS結(jié)構(gòu)性質(zhì)和起泡性的影響

為了探討影響SSPS起泡性的結(jié)構(gòu)要素究竟是酯化度還是蛋白質(zhì)含量，采用木瓜蛋白酶對(duì)相同分子量和酯化度的SSPS進(jìn)行酶解處理。如表3所示，隨著酶解時(shí)間的提升，產(chǎn)物SSPS中蛋白含量逐漸降低，SSPS的重均分子量、單糖組成和酯化度并未發(fā)生顯著改變。說(shuō)明蛋白酶酶解處理并不會(huì)破壞SSPS的主鏈和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響其甲酯基結(jié)構(gòu)。

表3 不同酶解條件下SSPS的重均分子量、酯化度、蛋白含量和單糖組成?

如圖3所示，隨著蛋白含量的逐漸降低，SSPS的泡沫膨脹率和泡沫穩(wěn)定性均顯著下降。對(duì)照分析表2和圖2中不同酯化度SSPS及其起泡性的結(jié)果可以得出結(jié)論，蛋白含量對(duì)SSPS的起泡性能相比于酯化度而言，有著更為重要的作用。

字母不同表示不同樣品之間存在顯著差異(P<0.05)

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了可溶性大豆多糖制備過(guò)程酸水解、堿脫酯和木瓜蛋白酶酶解對(duì)產(chǎn)物的單糖組成、分子量、酯化度和蛋白含量等結(jié)構(gòu)性質(zhì)和起泡性能的影響。結(jié)果顯示：酸性水解過(guò)程會(huì)破壞可溶性大豆多糖主鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)而使分子量逐漸降低；堿脫酯過(guò)程對(duì)可溶性大豆多糖的主鏈和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)影響很小，但可以使其結(jié)構(gòu)中的蛋白含量降低；蛋白酶水解可以降低蛋白質(zhì)含量但不影響分子量和酯化度。隨著分子量的降低，可溶性大豆多糖的泡沫膨脹率逐漸增大，但泡沫穩(wěn)定性逐漸降低；與甲酯化度相比，可溶性大豆多糖結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)含量對(duì)其起泡性起著更為重要作用。

試驗(yàn)研究表明，酸水解條件下的制備過(guò)程可能會(huì)對(duì)可溶性大豆多糖結(jié)構(gòu)造成影響，但具體會(huì)如何改變可溶性大豆多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其起泡性質(zhì)，仍需要進(jìn)一步的研究，例如：利用光散射設(shè)備或原子力顯微鏡進(jìn)一步分析可溶性大豆多糖的結(jié)構(gòu)；對(duì)可溶性大豆多糖表面張力、臨界膠束濃度等方面的界面性質(zhì)進(jìn)行研究以進(jìn)一步解釋其起泡性能改變的原因。