高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法測(cè)定復(fù)合維生素B片中5種組分的溶出度

紀(jì)世彬

作者單位：上海市青浦食品藥品檢驗(yàn)所檢驗(yàn)室，上海201799

藥物的溶出度檢查是對(duì)工藝水平和制劑品質(zhì)的一種有效的評(píng)價(jià)手段，可以反映藥物的生產(chǎn)工藝、處方組成、晶型、粒度和輔料品種等的差異，也是有效評(píng)價(jià)制劑均勻度、活性成分和生物利用度的標(biāo)準(zhǔn)。溶出度作為體外實(shí)驗(yàn)相較生物利用度而言簡(jiǎn)單易行，作為質(zhì)量控制的指標(biāo)，不失為一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的手段［1］。復(fù)合維生素B片由泛酸鈣、維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6五種有效成分加工而成，臨床用于治療和預(yù)防由B族維生素缺乏所導(dǎo)致的各種疾病，現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品及制劑第一冊(cè)WS1-73（B）-89中僅規(guī)定了崩解時(shí)限檢查項(xiàng)［2］，但崩解時(shí)限檢查不能全面反映藥物在體內(nèi)的溶出情況，本研究自2018年7月至2019年1月建立的方法為考察復(fù)合維生素B片中5種維生素的體內(nèi)溶出情況提供了一種客觀的標(biāo)準(zhǔn)［3-5］。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀（配2996型二極管陣列檢測(cè)器）、BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2試劑和藥品煙酰胺（批號(hào)：100115-200703，含量：99.9%，100毫克∕支）、維生素B1（批號(hào)：100390-201304，含量：97.0%，100毫克∕支）、維生素B2（批號(hào)：100369-201504，含量：98.2%，100毫克∕支）、泛酸鈣（批號(hào)：100370-200301，含量：100%，100毫克∕支）、維生素B6（批號(hào)：100116-201103，含量：100%，100毫克∕支）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。復(fù)合維生素B片①（南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)180102）；復(fù)合維生素B片②（上海新黃河制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)02418002）；乙腈、庚烷磺酸鈉（色譜純），冰乙酸、三乙胺（分析純），鹽酸（優(yōu)級(jí)純），水（超純水）。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以5 mmol∕L庚烷磺酸鈉水溶液（含0.15%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0）為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B；梯度洗脫：0～4 min，95%A；4～15 min，95%～80%A；15～20 min，80%～95%A；20～25 min，95%A；流速：1.0 mL∕min；進(jìn)樣量：50μL；柱溫：3 5℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm（煙酰胺、維生素B2、維生素B6和維生素B1），210 nm（泛酸鈣）。

2.2溶液的配置

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取維生素B1對(duì)照品、維生素B2對(duì)照品、維生素B6對(duì)照品、及泛酸鈣對(duì)照品各10 mg，分別置于20、100、100、100 mL容量瓶，加0.005 mol∕L鹽酸溶解并稀釋至刻度。搖勻，作為對(duì)照品貯備液（1）、（2）、（3）、（4）。精密取煙酰胺對(duì)照品10 mg，置50 mL容量瓶中，精密加入對(duì)照品貯備液（1）5 mL、（2）20 mL、（3）3 mL、（4）10 mL，加0.005 mol∕L鹽酸溶解并稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液 按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0931第三法操作，以0.005 mol∕L鹽酸100 mL為溶出介質(zhì)，于（37±0.5）℃條件下，轉(zhuǎn)速為100 r∕min，于20 min取樣1 mL，立即經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算累計(jì)溶出百分率。

2.3檢出限試驗(yàn)及線性關(guān)系分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、4、6、8及10 mL分別置10 mL量瓶中，加0.005 mol∕L鹽酸稀釋至刻度，搖勻。取50μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果以峰面積y為縱坐標(biāo)，以各組分的濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。同時(shí)分別以信噪比約為10∶1和3∶1時(shí)的濃度作為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4精密度試驗(yàn)精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線三號(hào)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，注入液相色譜儀，連續(xù)6次進(jìn)樣測(cè)定峰面積，分別計(jì)算RSD。結(jié)果維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6、泛酸鈣的RSD分別為0.18%、0.10%、0.51%、0.65%、0.66%。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取復(fù)合維生素B片②20 min時(shí)的供試品溶液①，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6、泛酸鈣色譜峰面積的RSD分別為0.25%、0.17%、0.50%、0.45%、0.82%。

2.6加樣回收試驗(yàn)在溶出杯中按配方加入復(fù)方維生素B片②的輔料，取維生素B1、維生素B2、維生素B6與泛酸鈣對(duì)照品配置成每毫升各含500、450、50與200μg的混合溶液，分別取2、5、8 mL各3份，置于溶出杯中；取煙酰胺對(duì)照品配置成每毫升含1 mg的溶液，分別取5、10、15 mL各3份，置于上述溶出杯中，每個(gè)溶出杯加入0.005 mol∕L鹽酸至100 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法，記錄色譜圖見(jiàn)圖1，由結(jié)果可知，維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6、泛酸鈣的平均回收率分別為98.0%、98.7%、99.2%、96.0%、95.5%；RSD分別為0.45%、0.40%、0.19%、0.85%、0.90%（n＝9）。表明該方法回收率良好。

表1 回歸方程、檢測(cè)限和定量限

圖1 各成分的高效液相色譜圖：A為對(duì)照品溶液280 nm，B為對(duì)照品溶液210 nm，C為樣品溶液280 nm，D為樣品溶液210 nm

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇利用DAD檢測(cè)器，在各個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)組分的吸收，確定最大吸收波長(zhǎng)，同時(shí)兼顧各個(gè)組分定量測(cè)定的需要，最后選擇280 nm作為維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6的測(cè)定波長(zhǎng)，選擇210 nm作為泛酸鈣的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相中加庚烷磺酸鈉，和一定量三乙胺是為了改善組分的峰型和保留時(shí)間以及消除拖尾，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)維生素B1和維生素B2峰的保留時(shí)間也有影響，過(guò)低過(guò)高都不能達(dá)到理想的色譜分離或者總時(shí)間。由于泛酸鈣檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，考慮到甲醇的截止波長(zhǎng)為205 nm，故有機(jī)相確定為乙腈。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最后將流動(dòng)相優(yōu)化成為5 mmol∕L庚烷磺酸鈉水溶液（含0.15%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫。

3.3溶出度取樣時(shí)間及溶出介質(zhì)的選擇根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下方法，分別以50和100 r∕min的轉(zhuǎn)速，以水、0.1 mol∕L鹽酸溶液和0.005 mol∕L鹽酸溶液，于10、20、30、45、60 min取樣1 mL（同時(shí)補(bǔ)充預(yù)熱至37℃的溶出介質(zhì)1 mL），測(cè)定溶出百分率。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，在水中泛酸鈣的溶出量偏低；在0.1 mol∕L鹽酸溶液中，各組分的溶出量都偏低；在0.005 mol∕L鹽酸溶液中50 r∕min時(shí)在45 min時(shí)5種維生素的溶出率都達(dá)到95%以上；100 r∕min時(shí)在20 min時(shí)5種維生素的溶出率都達(dá)到95%以上。綜合以上結(jié)果，選擇100 r∕min，取樣時(shí)間為20 min的溶出條件。因維生素B2對(duì)光較敏感，見(jiàn)光易分解，故應(yīng)避光操作。

4 結(jié)論

本方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，可作為現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充，測(cè)定復(fù)合維生素B片中五種維生素的溶出度，更全面評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量。