連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法測定醬油中的亞硝酸鹽和硝酸鹽

楊 健，印 杰，鐘 霖，李 斌，邢朝宏*

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海），上海 200233）

亞硝酸鹽和硝酸鹽廣泛存在于人類生活環(huán)境中，是自然界中較普遍的兩類含氮化合物，也是工業(yè)生產(chǎn)中比較常用的食品添加劑。但是，攝入高劑量的亞硝酸鹽會(huì)對人體產(chǎn)生很大的毒性，而硝酸鹽進(jìn)入人體經(jīng)過口腔和腸道微生物作用后，會(huì)轉(zhuǎn)化為具有一定毒性的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在人體中還極易轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺，進(jìn)而對人體健康構(gòu)成潛在的威脅[1-2]。因此，國家對食品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量有嚴(yán)格的限定，GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定亞硝酸鹽的最大使用量為0.15 g/kg，硝酸鹽的最大使用量為0.5 g/kg，同時(shí)對其殘留量也作出明確規(guī)定，如醬鹵肉制品類的亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）、硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）最大殘留量均為30 mg/kg，而GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定腌漬蔬菜的亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的限量值為20 mg/kg。

醬油是中國傳統(tǒng)的調(diào)味料，主要以黃豆或豆粕、小麥或面粉為原料經(jīng)過制曲、發(fā)酵、壓榨等工序釀制而成[3-5]。陳艷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，幾種潮汕醬料中的亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）含量為0.5～2.8 mg/kg，硝酸鹽以（以硝酸根計(jì)）含量為94～214 mg/kg，而王楠等[7]研究發(fā)現(xiàn)，市場上銷售的老抽類醬油均含有一定量的亞硝酸鹽，并且與添加焦糖有直接的關(guān)系。目前，醬油相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中僅商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10431—2007《榨菜醬油》中規(guī)定亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的限量值為10 mg/L，而未對硝酸鹽的限量值作出明確規(guī)定。因此，通過對醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量進(jìn)行研究，可以調(diào)整醬油的日常推薦使用量以減少來源于醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽的攝入量，從而防止亞硝酸鹽和硝酸鹽的過量攝入帶來的危害。

亞硝酸鹽與硝酸鹽含量的測定在國標(biāo)GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中規(guī)定的第一法為離子色譜法、第二法為分光光度法、第三法為紫外分光光度法（蔬菜、水果中硝酸鹽的測定）。由于醬油顏色較深，通常呈紅褐色，且老抽醬油的顏色比生抽醬油更深，在波長538 nm處進(jìn)行分光比色時(shí)干擾較大，因而分光光度法無法有效測定亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，而采用活性炭脫色[8-10]后測定硝酸鹽的干擾因素較多，需采取步驟消除共軛離子及亞硝酸鹽的干擾；電化學(xué)方法[11-12]制備電極的試驗(yàn)步驟繁雜，且成本較高；高效毛細(xì)管電泳法[13]則由于氯離子容易對亞硝酸根離子的測定產(chǎn)生干擾；離子色譜法[14-16]由于醬油中較高鹽分對Ag柱和Na柱的損耗較大[17]。

本研究采用連續(xù)流動(dòng)分析（continuous flow analysis，CFA）-鹽酸萘乙二胺分光光度法[18-21]同時(shí)測定醬油中的亞硝酸鹽和硝酸鹽，即試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)后，自動(dòng)進(jìn)樣且采用氣泡隔斷樣品以降低樣品的擴(kuò)散和重疊，樣品和載液試劑在化學(xué)分析模塊中經(jīng)過惰性玻璃圈上下旋轉(zhuǎn)而得以混合，進(jìn)一步通過透析膜在線透析而被過濾和稀釋，能有效消除醬油的顏色和排除顆粒雜物干擾后，采用雙通道同時(shí)測量，即一條通道中亞硝酸鹽與磺胺重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，在540 nm波長條件下比色測得亞硝酸鹽含量；另一條通道采用鎘柱將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，測得亞硝酸鹽總量，再由測得的亞硝酸鹽總量減去試樣中亞硝酸鹽含量，即得試樣中硝酸鹽含量。與上述方法相比而言，連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法自動(dòng)化程度高，采用鎘柱還原操作方便，檢測效率高，可以在線即時(shí)查看亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量。本研究建立的連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法，可以定量測定醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽，從而為制定相關(guān)醬油標(biāo)準(zhǔn)中亞硝酸鹽和硝酸鹽的限量指標(biāo)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油A（X公司生抽）、醬油B（X公司老抽）、醬油C（XX公司老抽）：市售；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，以NaNO2計(jì)）、硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，以NaNO3計(jì)）：北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；磺胺（純度＞99.0%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鎘粒、聚氧乙烯月桂醚溶液：荷蘭Skalar公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、磷酸、鹽酸萘乙二胺（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

San++連續(xù)流動(dòng)分析儀：荷蘭Skalar公司；Elmasonic P型超聲提取器：德國Elma公司；SW22型恒溫振蕩水浴槽：德國Julabo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（220 g/L）：稱取220.0 g乙酸鋅，加30 mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1 000 mL。

飽和硼砂溶液（50 g/L）：稱取10.0 g 硼酸鈉，溶于200 mL熱水中，冷卻后備用。

載液（R1）：稱取85.0 g 氯化銨和1.0 g乙二胺四乙酸二鈉溶于800 mL水中，混合均勻，用氨水調(diào)節(jié)pH至8.5±0.1，用水定容至1 000 mL，加入1 mL聚氧乙烯月桂醚溶液。

顯色液（R2）：將100.0 mL 磷酸加入600 mL水中，再加入10.0 g磺胺和1.0 g 鹽酸萘乙二胺，攪拌至全部溶解，用水定容至1 000 mL。

亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.0 mL于200 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得5.0 μg/mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液和5.0 μg/mL硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液。

亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別移取亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液，加水稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度分別為0.025 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.30 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L；硝酸鹽質(zhì)量濃度分別為0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確量取2.0 mL試樣于試管中，加入2.0 mL飽和硼砂溶液，加入25.0 mL水并搖勻，于超聲提取器中提取15 min，加入2.0 mL亞鐵氰化鉀溶液和2.0 mL乙酸鋅溶液，靜置，待恢復(fù)至室溫后定容至50.0 mL。在室溫條件下以6 000 r/min離心5 min后過濾，濾液備用。同時(shí)做試劑空白。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別將亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液置于進(jìn)樣杯中，由進(jìn)樣器按程序依次取樣、測定。以測定信號值（峰高）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度（以NaNO2計(jì)，mg/L）或硝酸鹽質(zhì)量濃度（以NaNO3計(jì)，mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制亞硝酸鹽、硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）試樣溶液的測定

將試劑空白和試樣溶液按照上述方法進(jìn)行測定，得到試劑空白和試樣溶液的信號值（峰高），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）或硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.3中所述方法分別對亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰高（H）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表1。從表1可以看出，連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽和硝酸鹽分別在0.025～1.0 mg/L、0.25～5.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of standard curves

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

選取醬油B采用25 ℃振蕩15 min、100 ℃水浴加熱15 min、25 ℃超聲15 min進(jìn)行3平行提取，分別測定其亞硝酸鹽及硝酸鹽含量，結(jié)果見表2。由表2可知，采用25 ℃超聲15 min后測得的亞硝酸和硝酸鹽含量均明顯高于另外兩種提取條件，提取效率較高，同時(shí)相比100 ℃水浴加熱15 min后不需要長時(shí)間冷卻至室溫，試驗(yàn)操作簡單方便。因此，選取25 ℃超聲15 min作為醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽的提取條件。

表2 不同提取條件下醬油中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量Table 2 Contents of nitrite and nitrate in soy sauce under different extraction conditions

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（n=3）。下同。

2.3 回收率與精密度試驗(yàn)

在3種醬油中分別添加3個(gè)不同濃度（低、中、高）的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述方法進(jìn)行樣品前處理后采用連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法測定，每個(gè)濃度平行測定7次，分別計(jì)算亞硝酸鹽和硝酸鹽的加標(biāo)回收率，同時(shí)計(jì)算出精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果分別見表3和表4。由表3和表4可知，亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率在83.54%～98.56%，硝酸鹽的加標(biāo)回收率在92.95%～102.32%，同時(shí)亞硝酸鹽的精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在1.06%～2.51%，硝酸鹽的精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在0.53%～1.22%，滿足國標(biāo)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》標(biāo)準(zhǔn)中檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求，這表明該方法具有很好的準(zhǔn)確性和精密度良好，可以滿足檢測分析要求。

表3 醬油中亞硝酸鹽測定加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of standard recovery rates and precision tests of nitrite in soy sauce

表4 醬油中硝酸鹽測定加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rates and precision tests of nitrate in soy sauce

2.4 醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定

由表3和表4可知，3種醬油中亞硝酸鹽含量為0.293～0.646 mg/kg，硝酸鹽含量為10.25～27.83 mg/kg，充分說明3種醬油樣品中確實(shí)存在一定量的亞硝酸鹽和硝酸鹽，而且醬油B中的硝酸鹽含量相對較高。醬油在發(fā)酵生產(chǎn)過程中一般不會(huì)有亞硝酸鹽和硝酸鹽產(chǎn)出，而某些醬油產(chǎn)品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量相對較高，可能與發(fā)酵后產(chǎn)品的調(diào)配有關(guān)（如焦糖色素的添加），因此對醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽的限量值作出明確規(guī)定很有必要。

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時(shí)檢測醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽的連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法，采用超聲直接提取，同時(shí)以乙酸鋅-亞鐵氰化鉀體系作為沉淀劑，操作簡單方便，自動(dòng)化程度高。通過對回收率和精密度等指標(biāo)的考查，結(jié)果均顯示良好，表明采用連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法可以準(zhǔn)確、高效地測定醬油中亞硝酸鹽和硝酸鹽。此外，本研究建立的連續(xù)流動(dòng)分析-鹽酸萘乙二胺分光光度法也可以用于食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測，具有應(yīng)用廣泛、操作簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，尤其在水質(zhì)檢測和肉制品檢測中應(yīng)用較多，而目前采用雙通道同時(shí)測定食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的方法較少，可以進(jìn)一步擴(kuò)展用于一些重色的醬制產(chǎn)品（非指肉制品）的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定，具有一定的實(shí)際應(yīng)用意義。