α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離、篩選及鑒定

鄭 虹，陸小翠，鄧加聰，2

（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清 350300；2.近海流域環(huán)境測控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福清 350300；3.現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)福建省高等學(xué)校工程研究中心，福建福清 350300）

淀粉酶是一類水解淀粉和糖原的酶類總稱，可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、異構(gòu)淀粉酶等[1-2]。淀粉酶作為一類重要的工業(yè)酶，廣泛應(yīng)用于飼料、食品、發(fā)酵、醫(yī)療等領(lǐng)域[3-5]。在制糖、釀酒行業(yè)中，淀粉的糊化、液化、糖化等過程大多是在高溫下進(jìn)行的[6]，因此淀粉加工過程中需要耐高溫的淀粉酶，否則會耗費(fèi)大量的冷凝水，提高淀粉加工的成本[7-9]。

自然界中能分泌合成α-淀粉酶的主要微生物有黑曲霉[10]、扣囊復(fù)膜孢酵母[11]、芽孢桿菌[12]、古細(xì)菌[13]等。目前關(guān)于α-淀粉酶的研究主要集中在產(chǎn)α-淀粉酶菌株的分離篩選及選育、產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)特性研究等[11，13]。ROHBAN R等[14]在高鹽度的湖泊中分離出可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶等多種酶類的極端微生物；謝建華等[15]從酒廠附近的土壤中分離篩選到一株產(chǎn)淀粉酶的解淀粉芽孢桿菌。本實(shí)驗(yàn)從溫泉中分離篩選到一株產(chǎn)高溫淀粉酶的菌株，對該菌株進(jìn)行了初步鑒定分析，為該菌在釀酒、制曲等生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

分離樣品：福建省旗山溫泉的底泥（40 ℃）；

生工SK8255柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、DNA Marker、正向引物16S-F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）、反向引物16S-R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCG-CA-3'）等（均為分析純）：生工生物工程（上海）有限公司；蛋白胨、酵母粉、麥芽糖、可溶性淀粉、乙醇等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離/斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母粉5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.2；

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母粉5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，pH 7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，NH4Cl·12H2O 8 g/L，豆粕粉30 g/L，CaCO31 g/L，pH 7.0；

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，MaCl 5 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司；FA2204B型電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；722SP分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；TG16-WS高速臺式離心機(jī)：上海湘儀有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺：福州伍聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；CDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1α-淀粉酶產(chǎn)生菌的富集培養(yǎng)

取1 g土樣接種于富集培養(yǎng)基，40 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離與初篩

將上述富集液稀釋涂布于分離培養(yǎng)基，40 ℃倒置培養(yǎng)24 h。采用點(diǎn)接法，將單菌落用滅過菌的牙簽點(diǎn)接于分離培養(yǎng)基平板，40 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，加入碘液，分別測量透明圈直徑與菌落直徑，并算出二者比值，將比值大的菌落接種于試管斜面。每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。

1.3.3α-淀粉酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于試管斜面，40 ℃活化培養(yǎng)24 h；挑取活化后的菌株1環(huán)，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；將活化后的種子液按3%（V/V）的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，40 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，測定發(fā)酵上清液中α-淀粉酶的活性。每株重復(fù)3個(gè)平行。

1.3.4α-淀粉酶產(chǎn)生菌的形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)

將試管保存的菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，40 ℃倒置培養(yǎng)24 h。

參考文獻(xiàn)[16-17]對α-淀粉酶的產(chǎn)生菌進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化研究。

1.3.5 菌株16S rDNA基因序列的測定與分析

菌株基因組DNA按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：純化的PCR產(chǎn)物（10 ng/μL）1 μL、2.5 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）8 μL、Taq酶0.2 μL，引物（3.2 pmol/μL）1 μL，加滅菌的去離子水10 μL。PCR擴(kuò)增條件為96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，循環(huán)25次；60 ℃再延伸10 min，4 ℃保溫。

16S rDNA基因序列測序委托上海生工生物工程股份有限公司完成。測序序列與美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的已知序列進(jìn)行blast。采用MAGE4.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）算法（BootStrap的設(shè)定值為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[18-19]，進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.6 溫度對菌株生長的影響

將菌株接種于試管斜面活化24 h；挑取活化后的菌株1環(huán)，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，40 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；將活化后的種子液按3%（V/V）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）條件下，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液OD600nm值。

1.3.7 酶活力測定方法

發(fā)酵液8 000 r/min、4 ℃離心10 min，其上清液即為粗酶液。淀粉酶活力的測定采用3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid）法[20-22]。

α-淀粉酶酶活單位定義：pH 5.5，溫度為60 ℃的條件下，1 mL酶液1 min水解淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶用量為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的的葡萄糖含量，mg；VT為淀粉酶原液總體積，mL；VS為反應(yīng)所用的α-淀粉酶原液體積，mL；W為樣品的質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時(shí)間，min。其中VT=25 mL，VS=1 mL，T=5 min，W=0.001 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)α-淀粉酶菌株的分離篩選

2.1.1 高產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶菌株的分離

通過富集培養(yǎng)、稀釋涂布及平板分離等方法，從土壤中分離篩選到10株透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值比較大的菌株。結(jié)果見表1。

表1 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of α-amylase-producing strain

由表1可知，不同菌株產(chǎn)α-淀粉酶活性有一定的差異，根據(jù)菌株的D/d值，可以看出所篩選得到的菌株產(chǎn)α-淀粉酶活性的強(qiáng)弱如下：FA4＞FA8＞FA3＞FA5＞FA10＞FA1＞FA2＞FA9＞FA7＞FA6。

2.1.2 高產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將初篩得到的10株D/d值較大的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定該菌株產(chǎn)α-淀粉酶的酶活力，結(jié)果見圖1。

圖1 淀粉酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Secondary screening results of amylase-producing strain

由圖1可知，菌株產(chǎn)淀粉酶活性強(qiáng)弱如下：FA4＞FA8＞FA1＞FA7＞FA10＞FA6＞FA5＞FA9＞FA2＞FA3，與菌株D/d值有一定的差異，其中菌株FA4的淀粉酶活性最強(qiáng)，其酶活可達(dá)71.56 U/mL。所以選擇菌株FA4進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌株FA4的簽定

2.2.1 菌株FA4的形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)

圖2 菌株FA4的形態(tài)觀察結(jié)果Fig.2 Morphological observation results of strain FA4

由圖2可知，菌株FA4在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色，表面較濕潤，不透明，隆起，邊緣光滑。顯微鏡下觀察該菌體呈桿狀，革蘭染色為陽性。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 菌株FA4與芽孢桿菌的生理特征比較Table 1 Physiological and morphological characteristics of strain FA4 and Bacillus sp.

由表2可知，菌株FA4能利用檸檬酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽及丙二酸，能分解過氧化氫，能水解淀粉和酪氨酸，甲基紅試驗(yàn)呈陽性，V-P試驗(yàn)呈陽性，吲哚試驗(yàn)和苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性。

2.2.2 菌株FA4的16S rDNA序列分析鑒定

將提取到的菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 375 bp的16S rDNA基因。將所得到的16S rDNA基因序列進(jìn)行測序，測序后，與NBCI網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對，結(jié)果顯示該菌株序列與Bacillus thuringiensis的多菌株具有99%以上的同源性。抽取若干條同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株FA4的序列分析Fig.3 Sequence analysis of the strain FA4

由圖3可知，菌株FA4的基因序列與登錄號NR043403.1、MN643161.1的16S rDNA序列的同源性達(dá)到99%，表明菌株FA4與Bacillus thuringiensis親緣性最近。再結(jié)合菌株的形態(tài)及生理生化特征，將該菌命名為蘇云金芽孢桿菌FA4（Bacillus thuringiensis）。

2.3 培養(yǎng)溫度對菌株FA4生長的影響

不同的培養(yǎng)溫度對菌株FA4生長的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株的OD600nm值隨著培養(yǎng)溫度的升高，逐漸升高，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，OD600nm值達(dá)到最大值，表明40 ℃是該菌株的最適生長溫度；之后，隨著培養(yǎng)溫度的升高，生物量反而逐漸減少，當(dāng)培養(yǎng)溫度為55 ℃時(shí)，菌體仍有一定的生長，表明該菌株具有較強(qiáng)的耐熱性。

圖4 培養(yǎng)溫度對菌株FA4生長的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of strain FA4

3 結(jié)論

本研究從溫泉底泥中分離篩選到一株耐高溫的淀粉酶菌株，從菌株形態(tài)、生理生化特性及16S rRNA遺傳分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬，將其命名為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），該菌株具有具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在55 ℃條件下仍能生長。