酸菜發(fā)酵期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化分析

郝卓莉

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程系，河北石家莊 050081）

酸菜是酸漬大白菜的簡稱，是在低鹽浸漬下經(jīng)過微生物自然發(fā)酵而形成的蔬菜發(fā)酵制品，是我國特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一[1-2]。由于酸菜的制作環(huán)境相對(duì)開放或半開放，因而大量不同種類的微生物參與酸菜的發(fā)酵[3]，且不同地域環(huán)境制作的酸菜中微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）、梭菌屬（Clostridium）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）是酸菜發(fā)酵的主要微生物菌屬[4]。此外，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuter）、腸膜明串珠菌屬（Leuconostoc mesenteroides）和米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）是參與酸菜發(fā)酵的主要乳酸菌[5]。

目前，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)對(duì)酸菜中微生物種類的鑒定非常有限，嚴(yán)重低估了微生物豐度和多樣性。此外，鑒于一些微生物具有不可培養(yǎng)的特性，故系統(tǒng)全面地解析酸菜微生物的組成和變化始終是一項(xiàng)重要的挑戰(zhàn)。近年來，16S rRNA高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造食品中復(fù)雜微生物群落的研究，高通量測序不僅具有高通量、高覆蓋、高準(zhǔn)確率等特點(diǎn)，還可以全面地揭示樣本微生物群落的組成及多樣性等信息[6-7]。馬藝熒[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬在東北酸菜的細(xì)菌菌群中占據(jù)主要地位，是東北酸菜中的主要優(yōu)勢(shì)菌群。LIU Z等[9]研究表明，乳桿菌屬和片球菌屬（Pediococcus）是酸菜中的主要微生物菌屬。LIU Z等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬、片球菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和魏斯氏菌屬（Weissella）是自制酸菜發(fā)酵過程中的主要微生物菌屬。為了解自然發(fā)酵酸菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成，本研究按照東北地區(qū)傳統(tǒng)方法進(jìn)行酸菜的腌制，利用16S rRNA高通量測序技術(shù)對(duì)酸菜發(fā)酵細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行全面解析，旨在能夠全面準(zhǔn)確地分析酸菜發(fā)酵期間的微生物動(dòng)力學(xué)，并為建立酸菜微生物信息數(shù)據(jù)庫和優(yōu)化酸菜發(fā)酵工藝提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大白菜、食鹽：市售。

E.Z.N.A.? 水樣DNA 提取試劑盒：美國Omega公司；微生物高通量測序建庫試劑盒：北京諾禾致源公司；Phusion HF MM高保真聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）酶：美國BioLabs公司；MinElute? PCR Purification Kit：德國Qiagen公司；Truseq? 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）PCR-Free Sample Preparation Kit：美國Illumina公司；細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：北京諾禾致源公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina Miseq PE250型測序儀：美國Illumina公司；S1000型PCR儀、CFX96型熒光定量PCR儀、Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)、低溫冷凍離心機(jī)：美國Bio Rad公司；DYY-8C型水平電泳槽：北京六一儀器廠；VORTEX-3型旋渦混勻器：德國IKA公司；BT25S型準(zhǔn)微量分析天平：日本SANYO公司；BioPhotometer Plus型核酸蛋白測定儀、5810R型高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；NaneDrop 2000型超微量分光光度計(jì)：美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸菜的腌制

根據(jù)東北地區(qū)傳統(tǒng)方法進(jìn)行酸菜的腌制[11]，具體方法如下：挑選優(yōu)質(zhì)的大白菜，將其在室外晾曬2～3日（曬蔫、殺菌、去除一定的水分）后，摘除黃葉、老幫并清洗干凈，將整顆大白菜縱劈成兩半，浸入沸水煮2 min（使酶失活、改變大白菜中大分子的結(jié)構(gòu)、殺死部分蔬菜細(xì)胞、酵母和霉菌），撈出并瀝干水分，冷卻后，整齊擺入5 L的大缸中裝滿壓實(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的無菌食鹽水填滿密封。用塑料布將發(fā)酵罐口扎緊，置于20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～65%且避光陰涼的環(huán)境進(jìn)行自然發(fā)酵，取發(fā)酵1 d、15 d、30 d、45 d、60 d的酸菜水進(jìn)行微生物的提取，分別命名為SC1、SC15、SC30、SC45和SC60。為保證每次取樣的一致性，在大缸同一部位取3個(gè)樣本，置于-20 ℃條件下貯藏備用。

1.3.2 酸菜DNA提取及PCR建庫

利用E.Z.N.A.? 水樣DNA 提取試劑盒提取酸菜液樣本中微生物的基因組DNA。使用引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：包括模板DNA 10 ng，正向及反向引物各10 pmol，2×Phusion Master Mix 10 μL。擴(kuò)增程序參考沈毅等[12]的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂凝膠進(jìn)行電泳檢測。使用MinElute? PCR Purification Kit對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用Truseq? DNAPCR-FreeSamplePreparationKit制備測序文庫并添加接頭序列，經(jīng)NaneDrop2000確定文庫質(zhì)量，使用Illumina Miseq PE250測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

采用FLASH軟件[13]對(duì)測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，利用QIIME軟件[14]對(duì)低質(zhì)量的拼接序列進(jìn)行過濾，使用UCHIME軟件[15]去除嵌合體，從而獲得高質(zhì)量的Tags序列。根據(jù)UCLUST軟件[16]在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類，以所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[17]。利用Silva 132數(shù)據(jù)庫[18]對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。使用QIIME軟件[14]對(duì)樣本進(jìn)行多樣性分析。

1.3.4 總酸度的測定

酸菜水中總酸含量采用國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[19]方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

不同發(fā)酵時(shí)期酸菜樣本的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)序列的測定結(jié)果見表1。

表1 酸菜發(fā)酵期間樣本測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of sequencing data processing results during sauerkraut fermentation

由表1可知，5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜樣本共檢出466 132條原始序列，通過相關(guān)軟件過濾后最終得到391 964條有效序列。去除條形碼（barcode）和引物后，5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜樣本的平均堿基長度均在450 bp以上，且平均鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）所占的比率（G+C含量）為54.46%。此外，5個(gè)酸菜樣本的Q30值（Q30為質(zhì)量值＞30的堿基占總堿基數(shù)的百分比）均高于90%，說明測序數(shù)據(jù)可靠且質(zhì)量較好。

稀疏性曲線是判定樣本的取樣大小是否合理及確定測序深度是否可以覆蓋整個(gè)群落。5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜樣本的稀疏性曲線的變化見圖1。

圖1 酸菜發(fā)酵期間樣本細(xì)菌群落的稀疏性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community of samples during sauerkraut fermentation

由圖1可知，不同顏色的稀疏性曲線代表該發(fā)酵時(shí)期樣本的稀疏平均值，隨著測序深度的增加，被檢測發(fā)現(xiàn)的OTU呈先迅速增加，后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，說明測序深度足夠的覆蓋整個(gè)酸菜發(fā)酵的群落。從而進(jìn)一步說明16S rRNA高通量測序技術(shù)有助于全面解析酸菜微生物群落的組成。

2.2 細(xì)菌群落的多樣性分析

在97%的相似度閾值下，對(duì)391 964條有效序列進(jìn)行聚類分析，根據(jù)QIIME軟件進(jìn)行OTU劃分，并根據(jù)得到OTU進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果見表2。

表2 酸菜發(fā)酵期間樣本細(xì)菌Alpha多樣性結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of Alpha diversity results of bacteria during sauerkraut fermentation

由表2可知，酸菜發(fā)酵1 d、15 d、30 d、45 d、60 d樣本中細(xì)菌的OTU數(shù)量分別為128個(gè)、101個(gè)、89個(gè)、92個(gè)和95個(gè)。SC1細(xì)菌群落的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最大，且Simpson指數(shù)最小，表明SC1中細(xì)菌菌群的多樣性最高。酸菜的發(fā)酵是由多種微生物共同調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)其發(fā)酵的不斷進(jìn)行。隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷進(jìn)行，酸菜樣本中細(xì)菌群落的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)呈先降后緩慢增加的趨勢(shì)，而Simpson指數(shù)則呈相反的趨勢(shì)。這與DU R等[20]的研究結(jié)果一致，推測與酸菜發(fā)酵液的環(huán)境變化有關(guān)，一些不耐酸或不耐鹽的微生物在低pH且低鹽環(huán)境下生長受到抑制。

進(jìn)一步對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜樣本中細(xì)菌菌群的構(gòu)成進(jìn)行比較分析并繪制韋恩（Venn）圖，結(jié)果見圖2。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜發(fā)酵樣本中操作分類單元（OTU）的Venn圖Fig.2 Venn diagram of operational taxonomic unit in sauerkraut fermentation samples with different fermentation period

由圖2可知，5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期點(diǎn)的樣本共有的OTU數(shù)為65個(gè)，而酸菜發(fā)酵期間1 d、15 d、30 d、45 d和60 d樣本中細(xì)菌的OTU數(shù)量分別為41個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、7個(gè)和7個(gè)。結(jié)合Alpha多樣性分析結(jié)果，多樣性最豐富的發(fā)酵SC1樣本中存在41個(gè)特有的OTU，凸顯酸菜原料中微生物菌群的復(fù)雜性和特殊性。

對(duì)上述得到的OTU表進(jìn)行Beta多樣性分析，利用非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析對(duì)酸菜樣本中細(xì)菌群落的演替進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 基于酸菜發(fā)酵樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的非度量多維尺度法分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling analysis of fermented sauerkraut samples based on the structure of bacterial community

由圖3可知，NMDS的結(jié)果表明酸菜發(fā)酵期間細(xì)菌群落在NMDS1和NMDS2的分布是不同的，這就意味著在酸菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落存在差異。SC1樣本與其他樣本之間的距離最遠(yuǎn)，說明SC1樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他樣本差異最大。而SC45和SC60這兩個(gè)樣本之間的距離最近，說明SC45和SC60樣本的酸度變化比較穩(wěn)定，且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近似。此外，根據(jù)NMDS結(jié)果可知，酸菜發(fā)酵期間細(xì)菌群落的變化呈類似拋物線的趨勢(shì)變化，說明某些主要的微生物影響了酸菜發(fā)酵過程，可能正是這些微生物推動(dòng)酸菜的發(fā)酵。

2.3 細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)分析

在劃分OTU后，挑選不同OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，隨后與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行97%相似性比對(duì)分析，從而對(duì)酸菜發(fā)酵期間得到的每個(gè)OTU進(jìn)行分類學(xué)鑒定，在分類學(xué)門水平揭示酸菜發(fā)酵期間細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，酸菜發(fā)酵期間的細(xì)菌群落分別來自酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和變形菌門（Proteobacteria）。其中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門占整個(gè)測序序列的98%左右。這與LIU Z等[9]的研究結(jié)果相一致，說明這些門水平的微生物決定酸菜的發(fā)酵性能。此外，在酸菜發(fā)酵期間，變形菌門的相對(duì)豐度隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行而降低，而厚壁菌門的相對(duì)豐度則隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行而增加。SC1樣本中厚壁菌門的相對(duì)豐度只有9.64%，然而SC60樣本中厚壁菌門的相對(duì)豐度增加至97.97%。說明這些來自厚壁菌門的微生物都具有厭氧和耐酸等生長特性。

圖4 基于門水平酸菜發(fā)酵樣本中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of bacterial community structure in fermented sauerkraut samples based on phylum level

為了進(jìn)一步準(zhǔn)確揭示酸菜發(fā)酵期間細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，故從分類學(xué)的屬水平探究構(gòu)成酸菜發(fā)酵細(xì)菌群落的組成，并揭曉其在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，結(jié)果見圖5。

圖5 基于聚類分析和屬水平酸菜發(fā)酵樣本中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of bacterial community structure in fermented sauerkraut samples based on cluster analysis and genus level

由圖5可知，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)SC1與其他樣本的距離是最遠(yuǎn)的，而SC45和SC60則可以聚在同一個(gè)分支。這個(gè)結(jié)果與圖3的結(jié)果是相一致，說明在酸菜發(fā)酵過程中微生物的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，從而導(dǎo)致功能也發(fā)生了明顯變化，進(jìn)而促進(jìn)酸菜的發(fā)酵。此外，將相對(duì)豐度＞1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。SC1樣本中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）（23.26%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（20.60%）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingomonas）（10.21%）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）（6.63%）、乳球菌屬（Lactocccus）（6.62%）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stentrophomonas）（5.21%）、歐文氏菌屬（Ewingella）（2.99%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（2.99%）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）（2.33%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（1.66%）、沙雷氏菌屬（Leuconostoc）（1.66%）、堅(jiān)固桿菌屬（Pectobacterium）（1.66%）、類香味菌屬（Myroides）（1.33%）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）（1.33%）。這與DU R等[20]的研究結(jié)果相似，但其在酸菜發(fā)酵初期沒有檢測到鞘氨醇桿菌屬和檸檬酸桿菌屬，且假單胞菌屬的相對(duì)豐度要遠(yuǎn)高于本研究結(jié)果，而明串珠菌屬的相對(duì)豐度顯著低于本研究結(jié)果，說明環(huán)境的差異造就酸菜發(fā)酵初期微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。鞘氨醇桿菌屬和檸檬酸桿菌屬均廣泛存在于我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，如醋[21]和辣白菜[10]。假單胞菌屬存在于新鮮蔬菜中，生存能力強(qiáng)，適應(yīng)環(huán)境范圍廣[22]。

隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，具有耐酸且厭氧特性的微生物可在該環(huán)境中迅速生長繁殖，并占領(lǐng)足夠多的生態(tài)位，而不耐酸的微生物的生長則受到抑制。由圖5可知，SC15樣本中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）（45.16%）、乳球菌屬（34.68%）、明串珠菌屬（6.13%）、假單胞菌屬（3.45%）、腸桿菌屬（2.35%）和魏斯氏菌屬（Weissella）（1.25%），相比SC1樣本，乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，假單胞菌屬和腸桿菌屬則顯著降低，說明乳酸菌是驅(qū)動(dòng)酸菜發(fā)酵的主要微生物。其他樣本中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要來自明串珠菌屬、乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和鹽單胞菌屬（Halomonas）。說明酸菜的發(fā)酵會(huì)顯著改變微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成。此外，本研究發(fā)現(xiàn)明串珠菌屬和乳酸乳球菌屬的相對(duì)豐度的變化在酸菜發(fā)酵期間呈先增后降的趨勢(shì)。有趣的是，在SC60樣本中不能檢測出乳酸乳球菌屬，而明串珠菌屬的相對(duì)豐度仍還有4.40%。說明明串珠菌屬能耐受更低的pH環(huán)境，這與SONG H S等[23]的研究相似，其發(fā)現(xiàn)在自然發(fā)酵50 d的韓國泡菜中明串珠菌屬的相對(duì)豐度為35%。鹽單胞菌屬、魏斯氏菌屬和乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度則在酸菜發(fā)酵過程中持續(xù)增加。在酸菜發(fā)酵期間，鹽單胞菌屬的相對(duì)豐度從0.03%增加至1.84%，而魏斯氏菌屬的相對(duì)豐度則從0.01%增加至8.26%。鹽單胞菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，推測其的存在與生產(chǎn)酸菜“鹽漬”這一步驟有關(guān)[24]。魏斯氏菌屬廣泛存在與含鹽的發(fā)酵食品中，可參與生成醛、醇和酮等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，還可使發(fā)酵食品的顏色更鮮亮和口感更醇厚[25]。SC1樣本中乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度極低，僅僅只有0.01%，而僅僅發(fā)酵15 d就可達(dá)到45.16%，說明乳桿菌屬可以迅速適應(yīng)酸菜的發(fā)酵環(huán)境，從而快速生長繁殖。而SC60樣本中的相對(duì)豐度可增加至82.32%，相比SC1樣本中乳桿菌屬的相對(duì)豐度增加了8 000多倍。乳酸菌是酸菜發(fā)酵最為重要的微生物之一，其在發(fā)酵期間可產(chǎn)生大量的有機(jī)酸（如乳酸、檸檬酸、乙酸等），導(dǎo)致酸菜發(fā)酵液的pH降低，進(jìn)一步抑制其他雜菌的生長繁殖。此外，乳酸菌不僅具有抑制腐敗微生物的生長的能力，還可以延長發(fā)酵食品的保質(zhì)期，提高產(chǎn)品的質(zhì)量安全[26]。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸，是酸菜酸味的主要來源，且在發(fā)酵過程中能與醇、醛和酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生大量的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[27]。

2.5 酸菜發(fā)酵過程中酸度的變化及相關(guān)性分析

酸度是決定酸菜產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素之一，酸菜發(fā)酵過程中總酸含量的變化見圖6。

圖6 酸菜發(fā)酵過程總酸含量的變化Fig.6 Changes of total acid contents during sauerkraut fermentation period

由圖6可知，酸菜發(fā)酵起始總酸含量為0.02 g/100 mL，隨著發(fā)酵進(jìn)行逐漸上升，于發(fā)酵45 d達(dá)到穩(wěn)定，其總酸含量為0.62 g/100 mL，而發(fā)酵60 d后達(dá)到最高0.65 g/100 mL。說明酸菜發(fā)酵45 d就可達(dá)到成熟。

進(jìn)一步對(duì)酸菜發(fā)酵過程中總酸和主要微生物菌屬的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，為了降低錯(cuò)誤率，只保留相關(guān)系數(shù)R＞0.6和顯著性（P＜0.05）值結(jié)果見圖7。

由圖7可知，總酸與乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬呈正相關(guān)，而與其他發(fā)酵過程中的主要微生物菌屬呈負(fù)相關(guān)，說明乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬是驅(qū)動(dòng)酸菜成熟的主要微生物菌屬，總酸是影響酸菜發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化的重要因素之一。乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬與假單胞菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、歐文氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、沙雷氏菌屬和水棲菌屬呈負(fù)相關(guān)，說明與乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬呈負(fù)相關(guān)的微生物菌屬大部分都是不耐酸的微生物菌屬，不能在酸菜發(fā)酵環(huán)境生長繁殖。

圖7 酸菜發(fā)酵過程中總酸與屬水平微生物之間的相關(guān)性Fig.7 Correlation analysis between total acid and bacterial communities in genes level during sauerkraut fermentation period

3 結(jié)論

本研究利用16S rRNA高通量測序技術(shù)主要研究了酸菜發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。從5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜樣本中收集的有效序列的平均堿基長度均在450 bp以上，且平均GC含量為54.46%；在97%相似度水平下聚類分析得到各樣本的OTU數(shù)分別為128個(gè)、101個(gè)、89個(gè)、92個(gè)和95個(gè)。不同發(fā)酵時(shí)期酸菜樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性均存在一定的差異，其中發(fā)酵第1天的酸菜樣本中微生物豐富度和多樣性最高。但隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，微生物豐度度和多樣性呈先降后緩慢增加的趨勢(shì)。結(jié)果表明，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵進(jìn)程顯著相關(guān)，因此不同發(fā)酵時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌屬不同。酸菜發(fā)酵期間的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和魏斯氏菌屬（Weissella）等，乳酸菌占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位。本研究可為建立酸菜微生物信息數(shù)據(jù)庫和優(yōu)化酸菜發(fā)酵工藝提供一定的理論基礎(chǔ)。