純種強(qiáng)化發(fā)酵細(xì)菌型水豆豉細(xì)菌菌群動(dòng)態(tài)研究

郭 婭，黃曉潤(rùn)，黎忠杰，曾金興，陶 怡，吳擁軍

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

豆豉是以黃豆、黑豆為主要原料，利用微生物發(fā)酵制成的調(diào)味副食品，是深受我國(guó)民眾歡迎的傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]。其中，水豆豉是以大豆為原料，煮熟堆積保溫發(fā)酵后添加佐料（辣椒、姜）而制成的市售產(chǎn)品。貴州水豆豉作為貴州地區(qū)特色微生物發(fā)酵大豆食品，其主要為細(xì)菌型豆豉。研究發(fā)現(xiàn)，豆豉中含有多種生理活性物質(zhì)，具有特殊的保健作用，能促進(jìn)皮膚、小腸粘膜損傷修復(fù)，保證機(jī)體生物氧化正常進(jìn)行，并含有18種氨基酸，其中7種為人體必需氨基酸[2-4]。此外，還具有和胃、除煩、祛寒的功效，對(duì)減少血中膽固醇、降低血壓也有一定作用。

迄今為止，對(duì)豆豉安全性方面的研究很少。在已有報(bào)道中，黃欣[5]從瀏陽(yáng)豆豉中分離出危害腎臟的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和可致動(dòng)物肝癌、胃癌的聚多曲霉（Aspergillus sydowi）；廖萬(wàn)清等[6]研究發(fā)現(xiàn)，聚多曲霉可引起阻塞性支氣管曲霉??；蔣立文等[7]研究發(fā)現(xiàn)，曾有因食用細(xì)菌型豆豉引起的A型肉毒毒素中毒事件；WEI C L等[8]研究發(fā)現(xiàn)，組胺、高濃度NaCl、黃曲霉毒素也對(duì)豆豉食用性產(chǎn)生影響，所以豆豉內(nèi)微生物種類對(duì)食用安全存在極大影響，是一個(gè)值得關(guān)注的焦點(diǎn)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技術(shù)能分離長(zhǎng)度相似但序列組成不同的雙鏈聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物[9-10]，是檢測(cè)微生物群落遺傳多樣性的主要分子生物學(xué)方法之一。MUYZER G等[11]在1993年首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)[12-13]的研究，1999年首次應(yīng)用于食品微生物多樣性檢測(cè)[14-15]。目前，DGGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究[16-17]。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)首次對(duì)貴州枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2純種強(qiáng)化發(fā)酵的細(xì)菌型水豆豉工廠化生產(chǎn)過程中前發(fā)酵（制曲期間）和后發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群變化進(jìn)行研究，解析細(xì)菌型水豆豉生產(chǎn)過程中食源性致病菌的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)評(píng)估其生物安全性以及指導(dǎo)生產(chǎn)控制具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

豆豉樣本：貴陽(yáng)某水豆豉生產(chǎn)企業(yè)。

1.1.2 菌株與載體

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ 3-2、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；測(cè)序載體pGEM-T Easy Vector System I：美國(guó)Promega公司。

1.1.3 試劑

尿素、三羥甲基氨基甲烷、甲叉雙丙烯酰胺：美國(guó)BIO-RAD公司；過硫酸銨：北京Solarbio公司；乙二胺四乙酸二鈉、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國(guó)AMRESCO公司；冰醋酸：重慶川江化學(xué)試劑廠；GelRedTM 1000：美國(guó)BIOTIUM公司；氯化鈣：德國(guó)Sigma公司；瓊脂糖：吉恩（上海）貿(mào)易有限公司；甲醛：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：上海根生生物科技有限公司；NaCl：蘇州同盛醫(yī)藥科技有限公司；瓊脂粉：美國(guó)Sigma-Aldrich（集團(tuán)）有限公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit Ⅰ（200）、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）：美國(guó)Omega公司；Bacterial Genomic脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Extraction Kit Ver.3.0：日本Takara公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉1 g，瓊脂粉3 g，去離子水100 mL，調(diào)pH值至7.2。LB液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂粉。

1.2 儀器及設(shè)備

DCodeTMUnivesrsal Mutation Detection System、C1000 TouchTMThermal Cycler、Univesrsal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Eppendorf Centrifuge 5417R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Applied Biosystems Veriti 96 Well ThermalCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：上海拜力生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 純種強(qiáng)化發(fā)酵細(xì)菌型水豆豉工藝[18]

將高溫高壓（110 ℃、20 min）蒸煮好的黃豆，冷卻至40～50 ℃，活化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2菌液使其OD600nm值在0.5～0.8，按4%接種量噴霧接種，攪拌均勻，置于發(fā)酵室，37 ℃發(fā)酵66 h（前發(fā)酵）制曲，按配方添加輔料（生姜、辣椒、食鹽），裝瓶，放入恒溫室，40 ℃發(fā)酵7 d（后發(fā)酵），即為成品水豆豉。

采用五點(diǎn)定時(shí)取樣法取200 g純種強(qiáng)化發(fā)酵細(xì)菌型水豆豉，混勻，4 ℃密封保存。前發(fā)酵為每6 h取樣一次，周期3 d；后發(fā)酵為每天取樣一次，周期7 d，共19個(gè)樣。

1.3.2 水豆豉宏基因組提取

分別取前發(fā)酵和后發(fā)酵期間不同時(shí)間段的水豆豉樣品5 g，置于10 mL無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）中，150 r/min離心30 min，自然沉降5 min，吸取1 mL菌懸液，12 000 r/min離心2 min，棄上清；加1 mL無(wú)菌水重懸清洗，12 000 r/min離心2 min，收集菌體。采用Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取水豆豉樣品的宏基因組，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

以水豆豉宏基因組為模板，選用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及1492R（5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.6 μL、27F 0.4 μL、1492R 0.4 μL、模板0.4 μL、rTaq酶0.1 μL、超純水15.1 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以16S rDNA序列為模板，采用引物338F（帶GC夾）（5'-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3'）及518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V3區(qū)序列進(jìn)行降落式PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、338F 1 μL、518R 1 μL、模板1 μL、rTaq酶0.25 μL、超純水37.25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃（每循環(huán)降0.5 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4 DGGE電泳及圖譜分析

參照MUYZER G等[11]方法，對(duì)16S rDNA的V3區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，凝膠成像拍照，用Quantity One分析電泳條帶差異。

1.3.5 DGGE切膠回收及克隆測(cè)序

切取DGGE明亮的目的條帶，加雙蒸水（ddH2O），4 ℃過夜保存。取1 μL上清液作為模板，用不帶GC夾的V3區(qū)引物338F'（5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'）及518R'（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）回收純化，與載體pGEM-T Easy Vector System I連接后，轉(zhuǎn)化至E.coli（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有60 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性單菌落加入含有60 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，委托大連寶生物公司測(cè)序。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity One 4.6.2軟件對(duì)DGGE圖片處理分析。將優(yōu)勢(shì)條帶和變化明顯的條帶切膠回收后測(cè)序，測(cè)序所得的16S rDNA的V3區(qū)序列提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)搜索[19]。采用Sensitivity 10、Lane Width 4mm、Min.Density 0.00%、Noise Filter 4.84、Shoulder Sens.1.0處理電泳條帶、粗定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水豆豉樣品宏基因組的提取

水豆豉樣品宏基因組的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，基因組條帶都較為完整、少量降解，基因片段堿基長(zhǎng)度在15 000 bp左右，可進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。

圖1 細(xì)菌型水豆豉前發(fā)酵（A）及后發(fā)酵（B）樣品的宏基因組Fig.1 Metagenome of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

2.2 PCR擴(kuò)增

以純種強(qiáng)化發(fā)酵細(xì)菌型水豆豉前發(fā)酵（A）及后發(fā)酵（B）樣品的宏基因組為模板進(jìn)行16SrDNAPCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且堿基長(zhǎng)度為1 500 bp左右，與目標(biāo)結(jié)果相符，可用其作為模板進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)序列PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且堿基長(zhǎng)度為250 bp左右，與目標(biāo)結(jié)果相符，可用于DGGE實(shí)驗(yàn)。

圖2 細(xì)菌型水豆豉前發(fā)酵（A）及后發(fā)酵（B）樣品16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of 16S rDNA of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

圖3 細(xì)菌型水豆豉前發(fā)酵（A）及后發(fā)酵（B）樣品16S rDNA V3區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

2.3 DGGE結(jié)果分析

通過quantityone 4.6.2軟件處理DGGE結(jié)果，結(jié)果見圖4。對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的DGGE條帶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖5。選取條帶明亮清晰度高的24條條帶進(jìn)行測(cè)序、鑒定，鑒定結(jié)果見表1。各個(gè)發(fā)酵時(shí)期水豆豉樣品中細(xì)菌的分布見圖6。

圖4 細(xì)菌型水豆豉樣品16S rDNA V3區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.4 DGGE map of PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacteria in bacterial water-Douchi samples

圖5 細(xì)菌型水豆豉樣品16S rDNA V3區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE條帶數(shù)Fig.5 DGGE band numbers of PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacterial water-Douchi samples

表1 DGGE條帶鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of DGGE band

續(xù)表

圖6 細(xì)菌型水豆豉樣品發(fā)酵過程中細(xì)菌的分布Fig.6 Distribution of bacteria in bacterial water-Douchi samples during fermentation

DGGE圖譜中每一泳道條帶的數(shù)量代表微生物的豐富度，亮度強(qiáng)弱代表細(xì)菌的數(shù)量。由圖4、圖5可知，在前發(fā)酵42 h后，細(xì)菌種類數(shù)量豐富并趨于穩(wěn)定。后發(fā)酵第5天細(xì)菌種類最多，推測(cè)是由于后期加輔料時(shí)帶入的外源細(xì)菌。由表1可知，24條條帶中有3條只能鑒定到屬，4條為未培養(yǎng)克隆細(xì)菌。整個(gè)發(fā)酵時(shí)期共鑒定出6個(gè)屬共15個(gè)種，分別為芽孢桿菌屬、沙雷菌屬、產(chǎn)堿菌屬、腸球菌屬、不動(dòng)桿菌屬以及變形桿菌屬。由圖4及圖6可知，枯草芽孢桿菌存在水豆豉的整個(gè)發(fā)酵期間，且數(shù)量最多，為主酵細(xì)菌。解淀粉芽孢桿菌一直存在發(fā)酵過程中，屬于優(yōu)勢(shì)菌。前發(fā)酵18 h后出現(xiàn)熱噬淀粉芽孢桿菌，分析可能由于曲溫達(dá)到50 ℃左右，適宜嗜熱細(xì)菌的生長(zhǎng)，而其他一些不適宜高溫的微生物則被抑制。同時(shí)，從中共檢測(cè)到6種條件致病菌，分別為粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）與鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）。其中，粘質(zhì)沙雷菌與糞產(chǎn)堿桿菌只存在前發(fā)酵0～6 h，推測(cè)可能是發(fā)酵前帶入的菌或發(fā)酵室環(huán)境污染。鮑曼不動(dòng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌、奇異變形桿菌、屎腸球菌在前發(fā)酵第66小時(shí)以及后發(fā)酵階段被檢出，推測(cè)可能是由于添加輔料時(shí)污染或輔料本身帶有。其中，P.mirabilis首次被發(fā)現(xiàn)存在于貴州細(xì)菌型水豆豉中。檢測(cè)到的屎腸球菌有較強(qiáng)的產(chǎn)酪胺和苯乙胺的能力[20]，而芽孢桿菌屬產(chǎn)尸胺，變形桿菌屬產(chǎn)組胺，沙雷氏菌屬產(chǎn)腐胺[21]。在豆豉發(fā)酵過程中，這4個(gè)菌屬細(xì)菌的存在影響貴州水豆豉生物胺含量。鮑氏不動(dòng)桿菌是目前臨床上較為常見的條件致病菌。有研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌有抑菌作用[22]。而蠟樣芽孢桿菌在10 ℃以下時(shí)停止繁殖，在100 ℃條件下處理20 min可被殺死，生長(zhǎng)最低水分活度為0.95[23]。因此，豆豉發(fā)酵可以通過添加抑菌性輔料（如大蒜素、辣椒、鹽等）或控制發(fā)酵條件（如溫度、濕度、含氧量等）[21-23]抑制甚至殺死原料中本身帶有或后期帶入的（條件）致病菌，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)豆豉的污染菌防控具有理論指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，純種強(qiáng)化發(fā)酵水豆豉前發(fā)酵42 h后，細(xì)菌種類及數(shù)量豐富并趨于穩(wěn)定，后發(fā)酵第5天，細(xì)菌種類達(dá)到最大。從中共鑒定出6個(gè)屬15個(gè)種，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、沙雷菌屬（Serratia）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、腸球菌屬（Enterococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）以及變形桿菌屬（Proteus）。整個(gè)發(fā)酵期間共檢測(cè)出6種條件致病菌，分別為粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）與鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、屎腸球菌（Enterococcus faecium），其中，奇異變形桿菌首次報(bào)道存在于貴州純種發(fā)酵細(xì)菌型水豆豉。證實(shí)純種強(qiáng)化發(fā)酵水豆豉有條件致病菌污染，具有潛在的食品安全隱患，因此，在水豆豉發(fā)酵過程加強(qiáng)注意環(huán)境衛(wèi)生、控制發(fā)酵條件可避免條件致病菌的產(chǎn)生。