利用微生物生物轉化大黃的研究進展

文 雅，于雪榮，王泓午，郝 征，邢竹青

（天津中醫(yī)藥大學健康科學與工程學院，天津 301617）

傳統(tǒng)的中藥提取主要是水煎或醇提法，但隨著現(xiàn)代發(fā)酵釀造工藝的不斷發(fā)展，利用微生物對中藥進行生物轉化成為一種新的趨勢。微生物在發(fā)酵中藥時，可以產(chǎn)生一些能夠分解轉化物質能力的微生物，并能夠產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，最終擴大用藥范圍，增強藥物的療效[1]。

現(xiàn)代微生物學研究表明，大黃能增加腸蠕動，保護腸道黏膜功能[2]；大黃有抗感染作用，對許多革蘭氏陽性和陰性細菌，如脆弱類桿菌、單形類桿菌等均有一定的抑制作用[3]；大黃對流感病毒和假狂犬病毒的滅活作用也十分明顯，且對艾滋病病毒、霍亂毒素也有一定的抑制作用[4]；大黃有利膽和健胃作用；此外，還有調節(jié)免疫、清除氧自由基、致泄、保肝利膽、保護心腦血管、改善微循環(huán)、抗腫瘤等作用[4]。目前，已有很多報道表明，大黃可以有效抑制食源性致病菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌），并能應用于食品保藏和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[5-7]。

本文將從大黃創(chuàng)新發(fā)酵技術優(yōu)勢、大黃發(fā)酵技術菌株種類和研究現(xiàn)狀、發(fā)酵技術目前的局限性幾個方面進行闡述，為今后發(fā)酵大黃的規(guī)模化生產(chǎn)提供指導和參考。

1 大黃傳統(tǒng)炮制的不足與大黃創(chuàng)新發(fā)酵技術的優(yōu)勢

隨著中藥市場需求的增大，傳統(tǒng)炮制加工方法帶來的有效成分利用率低，藥效不穩(wěn)定，加工過程繁瑣等問題也日益凸顯。大黃的傳統(tǒng)炮制方法也正存在上述問題（見表1）。

表1 傳統(tǒng)大黃炮制的不良影響Table 1 Adverse effects of traditional rhubarb processing

大黃生用瀉下作用劇烈，易引起腹痛、惡心等胃腸道反應。因此，在實際治療過程中，常經(jīng)不同的煎煮、加輔料炮制成各種炮制品，從而緩解大黃的瀉下作用及對胃腸道的不良反應。然而，大黃煎煮過程愈長瀉下作用愈弱，煎煮大黃不僅引起結合蒽醌的水解，還會導致游離蒽醌的降解，甚至還存在蒽醌類成分間的化學轉化[8-9]。國外報道長期應用大黃中蒽醌類成分可致肝、腎損害以及潛在的致癌風險[10-13]。這些問題都給大黃臨床應用過程提出了很高的要求。所以，進一步完善并創(chuàng)新大黃制劑的提取精制工藝，以減少蒽醌類成分的損失，對中藥大黃的高效利用及推廣有重要的現(xiàn)實意義[14]。

隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術的飛速發(fā)展，利用微生物進行發(fā)酵加工，較傳統(tǒng)炮制方法已有明顯優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在：（1）有利于實現(xiàn)中藥發(fā)酵技術的標準化，專業(yè)化。在繼承傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵技術的基礎上，利用現(xiàn)代微生態(tài)學的成果知識，結合現(xiàn)代微生物工程形成的中藥制藥新技術，完成一些常規(guī)炮制方法難以實現(xiàn)的反應，較大幅度地改變藥性，提高療效，降低毒副作用[21]。（2）有利于在中藥創(chuàng)新研究領域開辟新的研究方向。近年來對于中藥藥用功能的研究越來越深入，但卻缺乏制藥過程的創(chuàng)新和進步，此舉極大的阻礙了其實際臨床應用中的穩(wěn)定性。通過采取更為經(jīng)濟、安全、無污染的中藥發(fā)酵技術對中藥進行加工，開辟了其炮制過程的新角度和新思路。（3）有利于篩選具有我國自主知識產(chǎn)權的生物轉化菌株。我國目前利用微生物發(fā)酵法進行中藥生物轉化還處于剛剛起步的階段，發(fā)酵菌研究多集中于真菌[22]，大多使用常見的益生菌株進行發(fā)酵。所以，為了取得更好的生物轉化效果，需要不斷搜集菌株的資源，為形成我國具有自主知識產(chǎn)權的中藥生物轉化菌株庫奠定堅實基礎[23]。

2 中藥大黃發(fā)酵技術國內外研究現(xiàn)狀

國內應用的發(fā)酵工藝主要采用固體發(fā)酵[24]。在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集微生物自身的生長代謝和生命活動產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。但利用中草藥發(fā)酵生產(chǎn)藥物的研究起步較晚，20世紀80年代的研究主要集中在真菌類自身發(fā)酵，多為單一發(fā)酵產(chǎn)生次生代謝，如靈芝菌絲體、冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵等[25]?，F(xiàn)代利用中草藥發(fā)酵的研究已從單味藥擴展到復方研究且取得顯著成果，楊海龍等[26]借助真菌靈芝產(chǎn)生的豐富酶系通過對薏苡仁的轉化，使薏苡仁的主要成分發(fā)生了變化?！翱祻挽`”為抗癌驗方，主要成分有靈芝發(fā)酵菌、黨參、麥冬、豬苓、薏苡仁、淮山藥等，經(jīng)生物發(fā)酵轉化后多數(shù)樣品具有抑制小鼠肉瘤生長的作用[27]。有研究使用酵母粉發(fā)酵大黃粗粉，發(fā)酵后，結合型蒽醌含量降低，游離型蒽醌含量增加6倍左右[15]。段維和[28]使用9株真菌對大黃進行發(fā)酵改性研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)疣狀毛癬菌發(fā)酵后抗菌活性明顯增強，游離型蒽醌含量增加3倍左右。劉洋等[29]使用多種益生菌組合（干酪乳桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母）制成菌劑后，應用于發(fā)酵復方中草藥（王不留行和益母草），發(fā)現(xiàn)可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量明顯提高。類似使用益生菌發(fā)酵大黃也有報道，明顯增強對于大腸桿菌的抑制作用[30]。

近年來，發(fā)酵藥材越來越受到研究者重視，在韓國和臺灣的學術界引起研究熱潮。有研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌發(fā)酵的五味子藥渣能夠提高仔豬的免疫功能[31-32]。陳茂彬[33]從根際土壤篩選到一株能轉化藜蒿黃酮類物質的菌株，根據(jù)形態(tài)及顯微結構特征可以初步鑒定為芽孢桿菌屬菌株，轉化后的總黃酮量是轉化前的7.56倍。國外對于中藥發(fā)酵的研究主要集中在酶和食品工程領域，在食品分析檢測過程中，以酶作為分析試劑，在基礎研究方法、檢驗儀器和設備、酶試劑的來源和儲存、標準分析方法的制定以及應用范圍上均領先于國內[33]。如對肉桂的研究，肉桂的菌絲和子實體在預防和治療肝病方面具有潛在價值，有望被開發(fā)成保健食品或新藥。而發(fā)酵和栽培技術的應用使這種藥用蘑菇的菌絲和子實體更容易獲得[34]。又如日本的納豆，用芽孢桿菌發(fā)酵大豆，利用芽孢桿菌中酶系豐富且能增加維生素K含量的特點，消除小腸內致病菌，其提取物也具有明顯的抗癌活性和降壓作用[35]。也有用真菌曲霉接種到大黃中，然后測定發(fā)酵和未發(fā)酵的大黃提取物的化學成分以及抗氧化、抗菌、抗癌的活性的相關報道[36]。

目前，大黃發(fā)酵的研究還處于初級階段，已有的國內相關研究報道較多，主要研究目標集中在發(fā)酵菌株的篩選及蒽醌類型的轉化；國外研究相對較少，主要致力于有效物質結構和含量的轉化分析[37-38]。由于應用現(xiàn)代科技技術對其展開科學研究時間較短，系統(tǒng)、成熟的利用微生物轉化技術還鮮見報道?，F(xiàn)有成果距離形成可供實際規(guī)模化生產(chǎn)尚有較大差距，有必要借鑒上述成功的經(jīng)驗，進行進一步深化的研究探討。

3 大黃發(fā)酵技術菌株種類

3.1 酵母菌作為發(fā)酵菌株

酵母菌作為發(fā)酵工業(yè)中的常用菌之一，在發(fā)酵大黃的研究中也被報道有很好的生物轉化效果。發(fā)酵后，使大黃中的結合型蒽醌有效地轉化為游離型蒽醌，從而降低大黃的峻瀉作用，進而降低對胃腸道或其他的不良反應。

高潔等[39]通過實驗證實，利用酵母菌發(fā)酵大黃，在一定條件下，游離型蒽醌的轉化率可達到42.369%。戴萬生等[15]研究發(fā)現(xiàn)，大黃經(jīng)酒精酵母、面包酵母分別發(fā)酵后，總蒽醌含量略有降低，分別為生品的97.8%、98.2%，與有關文獻[40]比較，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的炮制方法均普遍使大黃總蒽醌含量明顯降低，說明發(fā)酵法有利于保存大黃總蒽醌，發(fā)酵法優(yōu)于傳統(tǒng)的炮制方法。同時，大黃經(jīng)酒精酵母、面包酵母分別發(fā)酵后，結合型蒽醌含量降低，分別為生品的52%、48%，而游離型蒽醌含量大大增加，分別為生品的594%、648%。說明發(fā)酵法也能使大黃結合型蒽醌有效的轉化為游離型蒽醌。馬超等[41]通過實驗篩選到酵母菌株KM12，經(jīng)26S rRNA分子鑒定為馬克思科魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），用菌株KM12發(fā)酵法炮制中藥大黃，能夠使結合型蒽醌分解或轉化成游離型蒽醌，從而緩和大黃的峻烈瀉下作用。

3.2 霉菌和蕈菌作為發(fā)酵菌株

呂平[42]優(yōu)化了菌株素赭曲霉（Aspergillus ochraceus）LP-0301，通過鈉離子注入獲得大黃素高產(chǎn)菌株，并且優(yōu)化了發(fā)酵條件，使其最終產(chǎn)率達1.453 mg/L，比出發(fā)菌株提高2.96倍。因此由菌株LP-0301發(fā)酵產(chǎn)大黃素的含量較藥用植物高，有很好的開發(fā)價值。

鄔吉野[43]通過建立槐耳大黃雙向發(fā)酵體系，明顯提高了大黃的轉化。研究結果顯示，經(jīng)槐耳雙向發(fā)酵后，結合型蒽醌含量降低明顯，游離型蒽醌含量增加明顯，說明發(fā)酵法能使大黃結合型蒽醌轉化為游離型蒽醌，從而緩和大黃峻瀉作用，且雙向發(fā)酵后槐耳大黃菌質體系有新成分產(chǎn)生，并有一定的抑制腫瘤效果。

3.3 益生菌作為發(fā)酵菌株

由于益生菌在腸道功能改善研究中的突出表現(xiàn)，也有學者探討了利用不同益生菌發(fā)酵大黃后的產(chǎn)物變化。韓佳慧等[30]通過利用益生菌N-14對大黃進行發(fā)酵，發(fā)酵大黃與水煎液大黃相比，對大腸桿菌的抑制作用大大增強。王惠蕓等[44]在雙歧桿菌對12種中藥的發(fā)酵與抗菌活性檢測分析中發(fā)現(xiàn)：12種中藥通過雙歧桿菌的發(fā)酵作用，使得抗菌活性發(fā)生不同程度的變化。但大黃發(fā)酵前以及發(fā)酵之后對于細菌的抑制作用并沒有非常明顯的變化。

3.4 內源菌群發(fā)酵

利用內源菌群相對來說簡單易得，因此很多學者也對此進行了摸索。王楠[45]利用植物大黃地上葉片部分中存在的一種內生真菌-葉點霉菌為發(fā)酵菌株，R7269大黃酸為標準品，對實驗條件多次優(yōu)化后，測得葉點霉發(fā)酵液中總蒽醌類物質的平均得率可達23.96 mg/g。于志偉等[46]以一株分離自高原掌葉大黃的腐皮鐮刀菌R13為研究對象，通過調節(jié)初始pH以及添加丙酸和丙二酸，可以促進該菌生產(chǎn)大黃素，最終大黃素產(chǎn)量可達3.908 mg/L，有望成為大黃素高產(chǎn)菌株。

3.5 外源菌株發(fā)酵

目前，用于大黃發(fā)酵的菌株也有來自其他植物或動物資源，經(jīng)過生物轉化后的活性物質可用于抗氧化或改變腸道菌群結構。

楊玉紅等[47]以自主篩選的軟棗獼猴桃內生真菌Z2為發(fā)酵菌株，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后的大黃可生產(chǎn)具有多功能抗氧化活性的蒽醌，蒽醌類物質質量濃度為100 μg/mL時，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力為72.27%，對超氧陰離子的清除能力為13.33%，對烷基自由基的清除能力高達76.75%。王瑞風等[48]研究認為，大黃酸經(jīng)小鼠本身的菌群作用后，可增加糖尿病小鼠腸道中的擬桿菌，同時減少硬壁菌，使擬桿菌與硬壁菌的比例升高，而已有研究表明，擬桿菌比例的下降可以導致代謝紊亂[49]。

4 大黃發(fā)酵技術的局限性

就大黃本身來說，我國尚缺乏生物轉化大黃的深入研究。雖然目前已有多種微生物種類應用于大黃的發(fā)酵條件摸索，但存在實際應用生產(chǎn)轉化率不高的現(xiàn)實問題。發(fā)酵后的大黃所含成分及藥理作用的影響，也有待進一步研究發(fā)展。雖然我國的發(fā)酵技術歷史悠久，但中藥菌株發(fā)酵技術仍處于起步階段，存在諸多亟待解決的問題，例如：單一菌種與混合菌種之間的選擇，單味中藥與復方中藥之間的權衡，體內發(fā)酵與體外發(fā)酵的比較，生物制品和創(chuàng)新藥物的定位問題等[50]。對中草藥的成分進行生物轉化，進而確定轉化前后藥效的變化，需要微生物學、中醫(yī)學、中藥學、分析化學、藥理學等多學科參與。同樣，存在于發(fā)酵大黃開發(fā)中也有一系列的疑問需要解開：微生物發(fā)酵體系構成如何、發(fā)酵時是否改變了大黃的藥效成分，微生物代謝是否產(chǎn)生了新的成分，發(fā)酵后的大黃產(chǎn)物對于腸道疾病的作用效果如何？存在何種作用機制？這些無疑是一個個巨大的挑戰(zhàn)。

5 展望

利用微生物進行食品行業(yè)中的釀造和品質改良的傳統(tǒng)由來已久，也已取得非常突出成果，但是利用發(fā)酵技術轉化中藥成分還處于初級階段，擁有巨大的發(fā)展?jié)摿?。發(fā)酵工程和酶工程已被列為中醫(yī)藥領域創(chuàng)新轉化的重要項目之一，其中發(fā)展傳統(tǒng)中醫(yī)藥，是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、具有高科技水平的新技術[30]。有學者呼吁將單味中藥、具有類似或協(xié)同作用的中藥進行發(fā)酵，以達到產(chǎn)生新化合物、增強功效或者降低單一藥物不良作用的效果。中藥經(jīng)發(fā)酵、生物轉化后，其有效成分能被充分分離、提??；經(jīng)生物轉化更具有生物活性，在中藥現(xiàn)代化過程中具有重要地位。由此，在大黃的有效成分轉化過程中，借助中藥發(fā)酵技術，研究大黃發(fā)酵現(xiàn)狀的意義得以凸顯。應用現(xiàn)代生物技術大規(guī)模工業(yè)化提取中草藥的有效生物活性成分，發(fā)展具有中國特色的生物技術醫(yī)藥工業(yè)具有廣闊的前景。