2016 年～2018 年華東地區(qū)家禽沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析

仲 艷，王希玉，李海賓，馮 政，胡建樂，費(fèi)中杰，楊 銅，錢 程，張凱云，劉岳龍，秦 濤，陳素娟*，彭大新*

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 江蘇立華牧業(yè)股份有限公司，江蘇 常州 213100）

沙門菌（Salmonella）是一種非常重要的人獸共患病原菌，血清型眾多，目前已報(bào)道的血清型約有2600 種，中國至少有292 種。禽類感染沙門菌主要引起雞白痢、禽傷寒和副傷寒，主要侵害幼齡和青年動(dòng)物，多表現(xiàn)為腸炎和敗血癥；禽沙門菌病不僅可以水平傳播，還能垂直傳播[1]，可導(dǎo)致禽群生產(chǎn)性能降低，影響雛禽的存活率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大損失。目前，沙門菌被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)重要的食源性致病菌[2]，食物傳播是人類感染沙門菌的主要途徑，畜禽及其肉制品和蛋是沙門菌等食源性病原菌的重要傳播基質(zhì)[3]。我國對(duì)禽沙門菌病非常重視，將其列為16 種優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一[4]。因此，禽沙門菌病的防治已成為養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的重要問題之一。

目前在家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重[5]，許多病原菌在選擇壓力下出現(xiàn)了多重耐藥[6]，結(jié)合近幾年華東地區(qū)禽沙門菌分離株的耐藥研究來看[7-8]，耐藥抗生素種類在逐年增加，這不僅給養(yǎng)殖業(yè)沙門菌病的防控帶來困難，終究會(huì)對(duì)人類健康造成威脅。因此，本研究對(duì)2016 年～2018 年華東地區(qū)不同地方的家禽沙門菌進(jìn)行了持續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查及耐藥性研究，并做了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為預(yù)防和控制沙門菌病的流行及傳播提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源2016 年～2018 年于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院畜禽門診及養(yǎng)殖場送檢樣本中采集患病雞、鴨、鵝和鴿的疑似沙門菌感染的肝臟樣品各195份、67 份、138 份和37 份，主要來于華東地區(qū)的揚(yáng)州、南京、鎮(zhèn)江、淮安、滁州、天長及六安等地的養(yǎng)禽場。

1.2 主要試劑普通LB 培養(yǎng)基所需蛋白胨和酵母提取物為英國OXOID 公司產(chǎn)品；純化瓊脂粉購自國藥集團(tuán)；沙門菌顯色培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技公司；2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊公司；瓊脂糖購自Biowest 公司；21 種藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤藥業(yè)有限公司。

1.3 革蘭氏染色鏡檢以常規(guī)無菌操作方法，用無菌接種環(huán)蘸取少量組織，劃線接種于顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取疑似菌落純化培養(yǎng)后挑取少許沙門菌菌液于載玻片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察細(xì)菌染色情況與形態(tài)。

1.4 沙門菌的多重PCR（mPCR）檢測采用楊林等建立的mPCR 方法[9]，以煮沸裂解法制備可疑細(xì)菌的DNA 模板，采用沙門菌屬特異性基因hut 及型特異性基因SdfI、Spy、glgc 和Spec 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，鑒定沙門菌類型。對(duì)檢測結(jié)果為沙門菌分離株的宿主來源、年份和季節(jié)因素進(jìn)行分析。

1.5 分離菌玻板凝集試驗(yàn)對(duì)于未知血清型的沙門菌，采用玻板凝集試驗(yàn)鑒定：首先用沙門菌A-F群O 抗原多價(jià)血清和H 抗原多價(jià)血清進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)，再用O 抗原單因子血清和H 抗原單因子血清進(jìn)一步鑒定，同時(shí)用生理鹽水作對(duì)照。按照Kauffman-White 分類體系進(jìn)行血清學(xué)分型。

1.6 藥敏試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取單個(gè)菌落，在LB 固體培養(yǎng)基上均勻劃線涂布于整個(gè)培養(yǎng)基表面。取藥敏紙片貼到LB 固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)16 h～18 h 后量取抑菌圈直徑，重復(fù)3 次，取平均值。參考杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》判斷該菌對(duì)不同藥物的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌的形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)純化培養(yǎng)后觀察可見，在顯色培養(yǎng)基上分離菌呈紫紅色或紫羅蘭色、扁平透明的菌落。革蘭氏染色結(jié)果呈紅色、兩端鈍圓的短桿菌，為革蘭氏陰性菌（圖1）。

圖1 沙門菌的革蘭氏染色試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Gram staining of Salmonella

2.2 沙門菌的mPCR鑒定經(jīng)mPCR鑒定，可疑菌株中有233株可擴(kuò)增出495 bp的屬特異性條帶（圖2），表明均為沙門菌。

圖2 沙門菌分離株的mPCR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of Salmonella isolates by mPCR

2.3 沙門菌的血清分型及沙門菌分離株的宿主來源和季節(jié)分布結(jié)合mPCR 試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn)鑒定分離株血清型，血清型鑒定結(jié)果表明，110 株可同時(shí)擴(kuò)增出401 bp 的型特異性條帶，為鼠傷寒沙門菌（47.21%）；82 株可同時(shí)擴(kuò)增出252 bp 的型特異性條帶，為雞白痢沙門菌（35.19%）；25 株可同時(shí)擴(kuò)增出304 bp 的型特異性條帶，為腸炎沙門菌（10.73%）（圖2）。剩余的16 株經(jīng)玻板凝集試驗(yàn)鑒定分別為5株德爾卑沙門菌（2.14%）、3 株紐波特沙門菌（1.29%）、2株波斯坦沙門菌（0.86%）、2株都柏林沙門菌（0.86%）、2 株豬霍亂沙門菌孔成道夫生物型（0.86%）、1 株邦戈?duì)柹抽T菌（0.43%）和1 株斯坦利沙門菌（0.43%）（表1）。以上結(jié)果表明，華東地區(qū)禽沙門菌的優(yōu)勢血清型是鼠傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌。

來源分布顯示雞源分離株以雞白痢沙門菌為主，鴨源、鵝源和鴿源分離株均以鼠傷寒沙門菌為主（表2）。季度分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，每年第二季度和第三季度沙門菌的分離率較高，第一季度和第四季度的分離率相對(duì)較低（圖3）。

表2 沙門菌分離株宿主來源統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Host sources of Salmonella isolates

圖3 沙門菌分離株季節(jié)分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Quarterly distribution of Salmonella isolates

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.4.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，近3年沙門菌臨床分離株普遍對(duì)青霉素、苯唑西林、利福平和紅霉素耐藥，尤其對(duì)青霉素、苯唑西林、利福平和紅霉素的耐藥菌株占比均達(dá)到了85%以上，最高至100%。2018年的沙門菌分離株對(duì)頭孢西丁、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥性有明顯的提高，耐藥菌株分別由0、6.41%和61.54%上升至57.5%、93.7%和87.5%。敏感性抗生素主要有慶大霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考和氯霉素，敏感菌株占比均在80%左右（表3）。結(jié)果表明，抗生素的大量使用會(huì)使沙門菌的耐藥特性發(fā)生改變。

表3 沙門菌分離株對(duì)抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Resistance rates of Salmonella isolates to antibiotics

2.4.2 沙門菌分離株的多重耐藥統(tǒng)計(jì)結(jié)果233 株禽源沙門菌分離株中，213 株對(duì)3 類及3 類以上抗生素（β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、利福霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、酰胺醇類、磺胺類）耐藥，多重耐藥菌株占比達(dá)91.42%。其中2016年、2017 年和2018 年分離株的多重耐藥菌株占比分別為91.03%、92.96%和90.48%（圖4），主要耐藥譜為苯唑西林-青霉素-利福平-紅霉素。表明沙門菌的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

圖4 233 株家禽沙門菌分離株對(duì)21 種抗菌藥物的多重耐藥譜Fig.4 Multi-drug profiles of 233 Salmonella isolates from poultry to 21 antimicrobial agents

3 討 論

沙門菌在自然界中十分普遍，對(duì)家禽健康和人類公共安全均具有嚴(yán)重的影響，是重要的人獸共患病原菌[10-11]。焦庫華等報(bào)道2005 年～2008 年在鹽城、南通、連云港、淮安等地的分離結(jié)果顯示，雞白痢沙門菌為優(yōu)勢血清型[12]；查華等報(bào)道2010 年～2012年在江蘇、安徽、上海等地的分離結(jié)果顯示，禽源沙門菌中雞白痢沙門菌為優(yōu)勢血清型[13]；張林吉等報(bào)道2014 年～2015 年在江蘇徐州地區(qū)禽源沙門菌的臨床檢測結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型[14]；沈?qū)W懷等報(bào)道在2015 年～2016 年安徽地區(qū)的沙門菌分離情況顯示，雞傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型[8]；段瑤等報(bào)道在2006 年～2016 年我國各地畜禽來源的沙門菌血清型鑒定結(jié)果表明，腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型[15]。本究結(jié)果表明，2016 年～2018 年從患病家禽中共分離到233 株沙門菌，鼠傷寒和雞白痢為優(yōu)勢血清型，鴨源、鵝源和鴿源分離株以鼠傷寒沙門菌為主，雞源分離株以雞白痢沙門菌為主，表明不同宿主、不同地區(qū)或不同養(yǎng)殖方式可能存在不同血清型沙門菌的流行，華東地區(qū)家禽源沙門菌優(yōu)勢血清型已發(fā)生了變化。

比較2016 年～2018 年的沙門菌分離株血清型種類可以發(fā)現(xiàn)，2016 年僅分離到鼠傷寒、雞白痢和腸炎3 種血清型；2017 年除了分離到鼠傷寒、雞白痢和腸炎血清型外，還有紐波特和邦戈?duì)栄逍?；?018 年共分離到鼠傷寒、雞白痢、腸炎、德爾卑、紐波特、波斯坦、斯坦利、都柏林和豬霍亂沙門菌孔成道夫生物型?？赡艿脑蚴遣煌貐^(qū)禽類養(yǎng)殖場之間引種和交易的頻繁，或是由于不同禽類來源的復(fù)雜化，引起不同血清型沙門菌的傳播，導(dǎo)致越來越多的血清型在華東地區(qū)出現(xiàn)，這給沙門菌病的防治帶來更大的困難。

對(duì)不同季度的沙門菌分離率比較發(fā)現(xiàn)，不同季度的沙門菌分離率具有一定的差異，其中第二季度和第三季度分離率相對(duì)較高，第四季度次之，第一季度最低。季度差異的出現(xiàn)，除了氣溫的巨大差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌增殖和傳播的差異，可能與養(yǎng)殖場在不同季度的飼養(yǎng)管理情況如消毒劑的使用和用藥情況也有關(guān)系。

臨床上抗生素的使用對(duì)抑制細(xì)菌性疾病的傳播與感染發(fā)揮了巨大的作用，而藥物的長期反復(fù)以及不合理使用，使沙門菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，耐藥譜也逐漸增寬。張博在2018 年的研究表明，遼寧省東部地區(qū)禽源沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率也已高達(dá)88.24%[16]；岳 秀 英 等 在2009 年～2014 年 對(duì) 雞 源 沙 門菌耐藥性變遷的調(diào)查研究結(jié)果表明，復(fù)方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素等耐藥率隨年份的推移呈上升趨勢[17]。本研究結(jié)果表明，近3 年華東地區(qū)沙門菌分離株的多重耐藥率一直維持在很高水平，均在90%以上。對(duì)頭孢西丁、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率有顯著的上升。因此，必須加強(qiáng)抗菌藥物的合理使用，遏制沙門菌耐藥的不斷發(fā)展。

鼠傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌是華東地區(qū)家禽中優(yōu)勢流行株，分離菌株的多重耐藥率高達(dá)91.42%，且對(duì)一些抗生素耐藥率顯著上升。本研究結(jié)果為華東地區(qū)家禽沙門菌的防治提供了科學(xué)依據(jù)。