廣東地區(qū)8 株鵝源基因XII 型新城疫病毒F 蛋白基因遺傳進(jìn)化分析

王杰煌，朱婉君，伍輝吉，鐘嘉誠，張溢珊，王 賀，劉英慧，張濟培,，陳濟鐺,*

（1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528225；2. 萬牧洲生物科技有限公司，廣東 佛山 528225）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由ND 病毒（NDV）感染禽類引起的一種高發(fā)病率、高死亡率的急性烈性傳染病[1]。NDV 分為class I 和class II 兩種譜系，每一類可再分為多個基因型和基因亞型，其中，class II 至少包括18 個基因型（I-XVIII）[2]。1990 年以來，中國主要流行的是以ZJ1 株為代表株的基因VIId 亞型NDV[3-4]，該亞型病毒感染家養(yǎng)水禽特別是鵝后呈高發(fā)病率和高死亡率特征，給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。近年，國內(nèi)禽源NDV 開始出現(xiàn)新的基因型和基因亞型，如2010 年，在廣東活禽市場首次監(jiān)測到基因XII 型NDV，隨后在廣東、福建等地多次分離得到該基因型病毒[5-6]。國際上，2004 年秘魯雞中首次發(fā)現(xiàn)基因XII 型NDV，隨后在哥倫比亞、越南等地也陸續(xù)出現(xiàn)XII 型NDV感染雞群的報道[7-8]。目前，我國XII 型分離株均屬XIIb 亞型，與上述國家分離到的XIIa和XIId亞型差異較大[5-9]。本研究從廣東臨床呈典型NDV 感染的病死鵝中分離鑒定得到8株XII型NDV，并對這8株NDV的F基因序列進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析，并對其F 蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，為進(jìn)一步了解廣東地區(qū)鵝源XII 型NDV 遺傳進(jìn)化、分子流行病學(xué)及疫苗株篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源臨床樣品采集自廣東地區(qū)表現(xiàn)疑似新城疫臨床癥狀的病死鵝，采集病料種類包括肝、脾、胰、腦共45份。各病毒株具體信息見表1。

表1 NDV 分離株信息表Table 1 Information of the eight NDV isolates

1.2 主要試劑DL2000 Marker、ExTaq 酶、LaTaq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime-ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit）、 隨 機 引 物（Random primer）、pMD18-T 克隆載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa 公司；RNA 抽提試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；血凝抑制試驗（HI）試驗標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成參考GenBank 登錄的NDV JSD0812 株F 基因序列（NC039223），利用Oligo 7 軟件設(shè)計NDV RT-PCR 鑒定引物1F：5'-AGGGTCATA CATAGTCAAGT-3'/1R：5'-TAGGTGGCACGCATATTA TATC-3'）及擴增病毒F 蛋白的完整編碼區(qū)序列（Coding Sequence， CDS）引 物2F： 5'-TATAGTCGACAT GGGCTTCAAACCTTCTACCAG-3'/2R： 5'-TATAGCG GCCGCTCATGCTCTTGTAGTGGCTCTCA-3'， 預(yù) 期 擴增片段大小分別為732 bp 和1 900 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒分離鑒定將采集的病料組織研磨、凍融后，上清液經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚，收集72 h 內(nèi)死亡的雞胚尿囊液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩κ斋@的雞胚尿囊液進(jìn)行血凝及血凝抑制試驗（HA/HI）；利用RNA 抽提試劑盒對NDV HA、HI 效價≥4 log2 的尿囊液提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后利用1F/1R引物經(jīng)RT-PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 NDV F 基因CDS 區(qū)域的PCR 擴增及測序以上述檢測為NDV 陽性的cDNA 為模板，2F/2R 為引物進(jìn)行PCR 擴增F 基因CDS 片段，PCR 擴增程序為95 ℃3 min；98 ℃10s，57 ℃30 s，72 ℃2 min，32個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后，克隆至pMD18-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，以2F/2R 為引物經(jīng)菌液PCR 鑒定，陽性菌液由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 F 基因同源性及遺傳進(jìn)化分析將本研究分離的NDV F 基因完整CDS 序列與GenBank 登錄的NDV參考株F 基因完整CDS 序列進(jìn)行比對分析其同源性，并利用MEGA 7 軟件繪制該基因CDS 的遺傳進(jìn)化樹。利用MegAlign 軟件進(jìn)行F 蛋白氨基酸關(guān)鍵位點分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒分離和鑒定結(jié)果將病料樣品上清經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚，有8 份病料組織液可致雞胚死亡，經(jīng)HA、HI 試驗結(jié)果顯示，8 份病料組織尿囊液HA、HI 效價均≥4 log2；RT-PCR 結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物在750 bp 處出現(xiàn)明亮條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符。上述結(jié)果表明，這8 份病料樣品均感染了NDV，且經(jīng)雞胚分離到了8 株NDV（表1）。

2.2 分離病毒F 基因CDS 的PCR 擴增結(jié)果以上述檢測為NDV 陽性的cDNA 為模板，2F/2R 為引物PCR 擴增F 基因CDS 片段，結(jié)果顯示8 株NDV cDNA均擴增出約1 900 bp 的明亮條帶，與預(yù)期目的條帶基本相符。進(jìn)一步表明分離得到了8 株NDV。

2.3 分離株F 基因CDS 核苷酸序列同源性分析結(jié)果分離株F 基因經(jīng)測序分析，結(jié)果顯示8 株NDV F 基因CDS 序列均為1 662 bp，共編碼533 個氨基酸，F(xiàn) 蛋白裂解位點序列均為112K/RRQKR/F117，符合NDV 強毒株分子特征。F 基因核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，8 株NDV F 基因之間核苷酸同源性達(dá)96.3%～99.9%；與2010 年～2011 年廣東分離到的XIIb 亞型NDV（Goose/China-GD450/2011 株）核苷酸同源性為97.4%～98.5%；與La Sota（基因II 型）、B1（基因II型）、clone 30（基因II 型）、V4（基因I 型）和Mukteswar（基因III 型）等疫苗株核苷酸同源性低，僅為83.0%～85.9%；與我國目前廣泛流行的VIId 亞型NDV 代 表 株ZJ/1/00/Go 核 苷 酸 同 源 性 為88.9%～89.7%；與國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強毒株F48E8（基因IX 型）核苷酸同源性為85.4%～85.9%。上述結(jié)果表明，本實驗分離的NDV F 基因與XII 型NDV F 基因核苷酸同源性最高，而與VIId 亞型病毒株以及常用疫苗株核苷酸同源性較低，提示廣東地區(qū)鵝中出現(xiàn)的XIIb 亞型NDV與當(dāng)前主要流行株及疫苗株F 基因差異較大。

2.4 F 基因遺傳進(jìn)化分析繪制本實驗分離株和GenBank 下載的48 株NDV 參考株的F 基因完整CDS序列遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，8 株新分離病毒的F 基 因 與2010 年～2011 年 廣 東 基 因XII 型 鵝 源 分 離株、秘魯、哥倫比亞以及越南基因XII 型雞源NDV F 基因均屬于class II 類。本研究分離的NDV 與2010年廣東XII 型NDV F 基因同屬XIIb 亞型，不同于南美病毒株（XIIa 亞型）及東南亞病毒株（XIId 亞型）；與國內(nèi)主要疫苗株La Sota、B1、clone 30、V4、Mukteswar4，重組新城疫病毒滅活疫苗株（A-VII 株）的親本株NDV/ZJ1F 基因處于不同分支（圖1）。結(jié)果表明，基因XIIb 亞型NDV 在廣東地區(qū)鵝群中流行時間較長，正逐漸形成新的XIIb 亞型進(jìn)化分支。

2.5 分離病毒F 蛋白氨基酸序列及相關(guān)位點分析比較本研究的8 株NDV 與VII 型重組滅活疫苗（A-VII株）親本株NDV/ZJ1 的F 蛋白主要中和抗原表位氨基酸序列（aa72、aa74～aa75、aa78-aa79、aa157～aa171和aa343 位）結(jié)果顯示，本研究分離的病毒株F 蛋白氨基酸序列均出現(xiàn)D170N 突變。本實驗分離的病毒株與2011 年廣東鵝中分離的XII 型病毒株（Goose/China-GD450/2011）相比，其在F 蛋白3 個疏水區(qū)（信號肽、融合誘導(dǎo)區(qū)、跨膜區(qū)）以及七肽重復(fù)序列[10-11]均有多個氨基酸殘基出現(xiàn)變異，其中F399、F407 出現(xiàn)一致的I9L、L15P、C25H、I118V、I510T 殘基替換，而F429、F438 出 現(xiàn) 一 致 的I10L、R18G、M20T、C25H、I118V 和I474L 變異；與V4、La Sota、Mukteswar、ZJ1和F48E8 株相比，其F 蛋白氨基酸序列差異明顯，其中信號肽區(qū)域變異最明顯，均出現(xiàn)L10P、T516I/M/G突變，與除ZJ1 株外的其余病毒相比均出現(xiàn)I16T、T17V、V121I 突變等（表2）。除上述區(qū)域外，本實驗分離的病毒株還出現(xiàn)N240S、T496I 突變，該結(jié)果與2017年從廣東清遠(yuǎn)鵝中分離到的Goose/CH/GD/E115/2017株的F 蛋白氨基酸變異相同[10]。上述結(jié)果表明，與常見疫苗株、主要流行株、甚至2010 年～2011 年分離到的XIIb 亞型NDV 相比，本實驗分離株F 蛋白中和抗原表位等功能區(qū)域均存在差異，這些差異可能引起F 蛋白構(gòu)象變化導(dǎo)致病毒對鵝致病力增強。值得注意的是，本實驗8 株基因XII 型NDV 均分離自病死鵝，屬國內(nèi)首次報道?；騒II 型NDV 對鵝致病力是否出現(xiàn)變化，從而導(dǎo)致病鵝死亡有待進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，目前基因XII 型NDV 在廣東地區(qū)鵝群中的流行日趨廣泛，部分病毒株可引起不同日齡鵝發(fā)病、死亡，嚴(yán)重威脅水禽養(yǎng)殖業(yè)。結(jié)合本研究F 基因核苷酸序列同源性分析和F 蛋白氨基酸序列分析結(jié)果，表明XII 型NDV F 基因與當(dāng)前常用VIId型及其他常見NDV 疫苗株F 基因同源性較低，F(xiàn) 蛋白多個抗原位點氨基酸也存在差異，這些差異對基因XII 型病毒株各種生物特性，如宿主嗜性、毒力強弱、傳播能力以及免疫原性等有何影響，還有待進(jìn)一步研究。有必要持續(xù)關(guān)注并監(jiān)測基因XII 型NDV 流行、進(jìn)化情況和生物學(xué)特性變化，并進(jìn)行疫苗保護(hù)效力評價，及時有針對性地調(diào)整免疫疫苗、以加強對該病的防控。

圖1 NDV F 基因遺傳進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of NDV F gene

表2 F 蛋白功能位點氨基酸殘基變異情況Table 2 Variations of amino acid residues in the functional sites of F protein