梨小食心蟲生物鐘基因Gmper和Gmtim的鑒定及其對羽化節(jié)律的影響

方海波, 張 璟, 劉小俠, 張青文, 李 貞

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系, 北京 100193)

梨小食心蟲Grapholitamolesta屬鱗翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)，簡稱“梨小”，是一種世界性果樹害蟲，在我國除西藏以外的各果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。梨小食心蟲主要以幼蟲造成為害，果樹生長季前期主要為害桃樹新梢，后可轉(zhuǎn)入梨、蘋果、杏、李等多種果園蛀食為害果實(陳梅香等, 2009)。梨小食心蟲蛀梢導(dǎo)致果樹長勢減弱，蛀果后又可嚴重降低果質(zhì)和產(chǎn)量，影響果農(nóng)收入(周仙紅等, 2011)。由于梨小食心蟲鉆蛀取食、為害隱蔽，因此有效防控時間短，常規(guī)防控難以獲得理想效果。

羽化、求偶、交尾、繁殖等過程是昆蟲行為節(jié)律研究的重要內(nèi)容。另外，害蟲羽化高峰期經(jīng)常是田間成蟲防治關(guān)鍵期。因此，掌握害蟲羽化規(guī)律對于適時開展有效防治具有重要參考意義。研究表明，昆蟲的羽化規(guī)律同時受光周期、溫度、性別等多種環(huán)境和個體因素的影響(Edmondsetal., 2000; Thiéryetal., 2014; Yadavetal., 2015)。例如，在自然條件下，條紋小斑蛾Thyrassiapenangae在弱光狀態(tài)下羽化率更高，羽化高峰也會隨著溫度的升高而提前，但羽化時間受光周期影響極小(何海敏等, 2015)；溫濕度對楊小舟蛾Micromelalophasieversi的羽化有極顯著影響，具體表現(xiàn)為隨溫濕度的增加其羽化率呈先上升后下降的駝峰式節(jié)律，并于光期溫度30±1℃、暗期溫度24±1℃、光期濕度50%±10%、暗期濕度70%±10%時達到最佳羽化效率，但不同光周期處理對其羽化節(jié)律無顯著影響(范立鵬等, 2014)；印鼠客蚤Xenopsyllacheopi的性比和羽化規(guī)律探究實驗發(fā)現(xiàn)，實驗室種群和野外種群中雌性均多于雄性，并且雄性的累積羽化率隨時間的變化呈S型增長規(guī)律，但雌性的羽化數(shù)量與時間呈線性負相關(guān)關(guān)系(孟鳳霞等, 2006)；楊小舟蛾雄蛹羽化高峰期比雌蛹提前4 d(范立鵬等, 2014)。

生物的行為節(jié)律均受生物鐘基因(circadian clock genes)的調(diào)控，目前確認的主要生物鐘基因有鐘蛋白基因(clock,clk)、周期蛋白基因(period,per)、永恒蛋白基因(timeless,tim)、周期循環(huán)蛋白基因(cycle,cyc)、雙時蛋白基因(double-time,dbt)、旋轉(zhuǎn)蛋白基因(vrille,vri)和隱花色素基因 (cryptochrome,cry)等。其中，以果蠅為模式的生物鐘基因研究較為深入。在果蠅體內(nèi), CLK和CYC可結(jié)合形成異二聚體，此二聚體在正午時分可以與E-box序列(CACGTG)結(jié)合，激活多個節(jié)律基因(如per,tim,vri或PAR結(jié)構(gòu)蛋白基因)啟動子的E-box元件。其中，節(jié)律行為的核心激活因子per和tim的mRNA在傍晚/夜晚時分被大量轉(zhuǎn)錄，PER蛋白和TIM蛋白在細胞質(zhì)中大量積累，TIM蛋白對PER蛋白的穩(wěn)定存在至關(guān)重要，缺少TIM蛋白的保護PER蛋白將被 Double-Time (DBT)激酶磷酸化，磷酸化的PER蛋白將被泛素化并隨之降解。夜間TIM和PER蛋白積累，各自或以異質(zhì)二聚體形式進入細胞核內(nèi)。PER可結(jié)合DBT激酶共同進入細胞核內(nèi)，進入細胞核后，PER-DBT-TIM復(fù)合體靶標(biāo)CLK和CYC，終止CLK和CYC的轉(zhuǎn)錄。白天期間CRY蛋白促進TIM的降解進而導(dǎo)致PER/TIM的降解，CLK和CYC的轉(zhuǎn)錄重新激活，這樣在光照驅(qū)動下，相應(yīng)生物鐘基因呈現(xiàn)約24 h的周期性變化，對外表現(xiàn)為生物體的晝夜節(jié)律性(Collinsetal., 2006; Tataroglu and Emery, 2014)。與此同時，VRI和CWO對CLK的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也共同參與生物體晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)作用(Zhouetal., 2016)。

在生物鐘反饋回路中，per和tim基因作為核心激活因子具有極其重要的作用。因此，對重要蛀果害蟲梨小食心蟲生物鐘基因per和tim的分子鑒定及兩基因在梨小食心蟲羽化過程中的功能分析將為進一步明確生物鐘基因?qū)[翅目害蟲羽化節(jié)律的調(diào)控作用和監(jiān)測害蟲羽化規(guī)律進行適時防控提供數(shù)據(jù)參考，同時可為開發(fā)基于發(fā)育行為節(jié)律調(diào)控的梨小食心蟲防控方法提供新線索。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本實驗的供試昆蟲來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)IPM實驗室長期飼養(yǎng)的梨小食心蟲室內(nèi)種群，原始種群采集于遼寧果樹科學(xué)研究所，并在室內(nèi)采用人工氣候箱連續(xù)培養(yǎng)30代以上，培養(yǎng)條件為光周期14L∶10D，溫度為26±1℃，相對濕度70%±10%。培養(yǎng)箱于早上8∶00時開燈，晚上22∶00時熄燈，記燈亮?xí)r間點為授時時間0 (ZT0)。具體飼養(yǎng)方法參照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)曹進軍等方法 (Caoetal., 2015) 并加以改進，具體操作如下：成蟲在干凈的2 000 mL玻璃燒杯中飼養(yǎng)，利用蘸有10%蜂蜜水脫脂棉飼喂成蟲，并于燒杯口蓋上一層紗布防止成蟲逃逸，燒杯內(nèi)放1～2個干凈無傷痕的蘋果和硫酸紙作為梨小食心蟲產(chǎn)卵場所；根據(jù)梨小食心蟲產(chǎn)卵情況及時更換蘋果，將更換下來的蘋果置于一次性塑料盒中，盒蓋上扎小孔透氣；約兩周后，將接有蟲卵的腐爛蘋果用手術(shù)刀小心剖開，將各齡幼蟲置于裝有人工飼料的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)至老熟，每日挑取4～5頭老熟幼蟲放入裝有人工飼料的10 mL指形管中，脫脂棉封口；化蛹后小心將蛹掏出并置于底部鋪有濕潤濾紙的一次性杯子中，雌雄成蟲羽化后配對交尾產(chǎn)卵。

1.2 梨小食心蟲Gmper和Gmtim的克隆

通過序列分析，從梨小食心蟲轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表)數(shù)據(jù)中獲得生物鐘基因Gmper和Gmtim的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計序列全長的擴增引物(表1)。

取10頭梨小食心蟲老熟幼蟲，采用Trizol法提取總RNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA產(chǎn)物的完整性，同時采用NanoDrop 2000檢測其濃度和純度，取1 μg質(zhì)量合格的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒)，cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以上述合成的cDNA為模板進行PCR擴增。由于預(yù)測序列較長，因此使用兩對引物進行擴增拼接。反應(yīng)體系: 2×PCR Mix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30個循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。

采用天根膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收，將純化的PCR產(chǎn)物連接至T載體 (北京全式金生物技術(shù)有限公司)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞 (天根生化科技有限公司)，隨后接種至帶有氨芐青霉素 (100 mg/mL, Sigma-Aldrich)的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑選多個陽性單克隆送至上海生工公司進行測序分析。

1.3 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用DNAMAN的ORF Finder工具預(yù)測克隆序列的開放閱讀框，并采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)進行結(jié)構(gòu)域鑒定，分析結(jié)果證明克隆所得的兩序列確實為梨小食心蟲生物鐘基因Gmper和Gmtim的cDNA序列全長，并將其提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。后續(xù)使用Expasy在線工具pI/Mw(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測其編碼蛋白分子質(zhì)量及等電點；利用NCBIblast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫檢索獲得其他昆蟲生物鐘基因序列，并采用DNAMAN6.0進行梨小食心蟲與其他昆蟲生物鐘基因氨基酸序列的多重聯(lián)配分析；采用MEGA6.06構(gòu)建鄰接(neighbour-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，同時選取親緣關(guān)系較遠的嚙齒目鼠科的PER和TIM分別作為GmPER和GmTIM的外群。

1.4 RT-qPCR檢測梨小食心蟲Gmper和Gmtim基因表達模式

根據(jù)所獲得梨小食心蟲Gmper和Gmtim開放閱讀框序列設(shè)計qPCR引物(表1)，并以EF-1α作為內(nèi)參基因(Caoetal., 2015; Wangetal., 2017)進行基因表達水平檢測。

收集梨小食心蟲羽化24 h內(nèi)雌、雄成蟲，用眼科鑷分別將頭、胸、腹、足取下后置于EP管中用于后續(xù)基因表達水平的組織特異性檢測，每性別每個組織樣品包括3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)的組織樣品來自20頭個體；另外，每隔3 h取1日齡雌、雄蛹頭部分別置于EP管中，持續(xù)取樣24 h，獲得雌雄蛹頭部各8個時間點樣品，用于檢測生物鐘基因在蛹頭部的表達水平隨時間的變化模式，每性別每個樣品包括3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)來自20頭個體。將上述樣品迅速置于液氮中冷凍，并于-80℃保存用于后續(xù)總RNA的提取。

總RNA提取及cDNA合成參照1.2節(jié)。采用SYBR Primer Script RT-PCR Kit (TaKaRa)進行qPCR檢測。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR 10 μL, ddH2O 7 μL, 正反向引物 (10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)后65～95℃ (每5 s增加0.5℃，用于特異性擴增的解離和熔解曲線分析)。

1.5 siRNA顯微注射及干擾效率檢測

本實驗通過注射siRNA進行靶標(biāo)生物鐘基因的RNA干擾。為保證干涉效率，基于1.2節(jié)克隆和測定的基因序列，為Gmper和Gmtim分別設(shè)計合成3段siRNA，引物序列見表1，由蘇州吉瑪基因股份有限公司完成。取梨小食心蟲2日齡蛹，分別將Gmtim的3段siRNA和Gmper的3段siRNA按1∶1∶1均勻混合，采用顯微注射儀(NanojectⅡ, 美國)分雌雄蛹分別注射。注射時將蛹置于冰袋上以降低其活動力，為避免對頭部的機械損傷，我們選擇從近頭的翅下進行扎入注射，每頭蟲注射1.5 μg siRNA，對照注射等量陰性對照(NC) (siRNA合成時由公司附贈，序列見表1)。注射后的梨小食心蟲單頭置于指形管中于正常條件下飼養(yǎng)。

注射后24, 48和72 h分別取樣(每個時間點3個重復(fù)，每個重復(fù)10頭個體)，進行總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄，并采用qPCR進行干涉效率檢測。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán); 65～95℃ (每5 s增加0.5℃，用于特異性擴增的解離和熔解曲線分析)。

1.6 梨小食心蟲羽化節(jié)律的觀察

另收集1.5節(jié)中成功注射的蛹30頭，以10頭為一重復(fù)置于事先放入濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為：溫度為26±1℃，相對濕度70%±10%，光周期14L∶10D。將皿置于攝像頭下記錄每頭蛹的羽化時間。

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算，其中ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因， ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照。用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。梨小食心蟲不同組織和羽化時間點的基因表達量采用SPSS軟件進行單因素方差分析(Tukey氏多重比較)；雌雄間同一組織的基因表達量的比較以及siRNA處理組與其相應(yīng)對照組間基因表達量、羽化率的比較均采用獨立樣本T檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

梨小食心蟲Gmper(GenBank登錄號: MN862636)的開放閱讀框序列長2 862 bp，編碼953個氨基酸，蛋白分子量107 kD，等電點為6.18；蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，序列中含2個PAS結(jié)構(gòu)域和1個PAC結(jié)構(gòu)域。Gmtim(GenBank登錄號: MN862637)開放閱讀框長3 048 bp，編碼1 015個氨基酸；推測相應(yīng)編碼蛋白分子量115.1 kD，等電點為5.13。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，梨小食心蟲GmPER與其他鱗翅目蝶類和蛾類的PER都聚在一簇，但與蜚蠊目、直翅目和雙翅目昆蟲的PER分別聚在不同分枝上；與PER系統(tǒng)發(fā)育情況不同，GmTIM與柑橘鳳蝶Papilioxuthus的TIM系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，并與甜菜夜蛾Spodopteraexigua、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、家蠶Bombyxmori和柞蠶Antheraeapemyi等鱗翅目蛾類的TIM聚在一簇 (圖1～4)。

圖4 鄰接法構(gòu)建的基于梨小食心蟲GmTIM與其他昆蟲TIM氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 4 Phylogenetic tree of GmTIM from Grapholita molesta and TIM proteins from other insect species based on amino acid sequence by neighbour-joining method (1 000 replicates)

2.2 Gmper和Gmtim的表達模式分析

Gmper和Gmtim在雌、雄成蟲頭部的表達水平均顯著高于兩基因在胸、腹、足中的表達水平；相同組織雌雄之間基因表達水平的結(jié)果分析表明，兩基因在雄成蟲胸和足中的表達水平均顯著高于雌成蟲(胸:tper=49.376,Pper=0.0003;ttim=16.770,Ptim=0.0007; 足:tper=19.318,Pper=0.002;ttim=15.741,Ptim=0.004<0.05)，雄成蟲腹部Gmper的表達水平高于雌蟲(t=4.338,P=0.012)，而雌蟲腹部Gmtim表達量顯著高于雄成蟲(t=3.608,P=0.023)，但頭部兩基因表達水平在雌雄之間均無顯著性差異 (tper=2.247,Pper=0.088;ttim=0.679,Ptim=0.534) (圖5)。

圖5 Gmper (A)和Gmtim (B)在梨小食心蟲成蟲不同組織中的表達量Fig. 5 Expression levels of Gmper (A) and Gmtim (B) in different tissues of Grapholita molesta adults 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母和大寫字母分別表示基因表達量在雄成蟲和雌成蟲不同組織間差異顯著(P<0.05, Tukey氏多重比較)；星號和ns分別表示雌雄成蟲之間表達水平差異顯著(P<0.05)和不顯著(P>0.05)(獨立樣本T檢驗)。Data in theFigure are mean±SE. Different lowercase letters and uppercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues of male adults and female adults, respectively (P<0.05, Tukey’s multiple comparison), and asterisk and ns represent significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, in the gene expression level between male and female adults (independent samples T-test).

蛹頭部兩基因的日表達模式分析表明，Gmper和Gmtim呈現(xiàn)出類似的表達節(jié)律，且Gmper的表達水平在所有檢測時間點均顯著低于Gmtim的表達水平。雌雄蛹中，Gmper在光期和暗期均各有一個表達高峰，雄蛹頭部光期的表達高峰出現(xiàn)在ZT12，暗期表達高峰出現(xiàn)在ZT18；雌蛹頭部光期表達峰值出現(xiàn)在ZT0，暗期表達高峰出現(xiàn)在ZT15；雄蛹頭部的表達峰值均出現(xiàn)在雌蛹之后(圖6: A)。Gmtim在梨小食心蟲蛹頭部的表達水平均呈現(xiàn)出暗期高于光期的表達趨勢，其中雌雄蛹的表達最低值均出現(xiàn)在ZT3，而表達峰值分別出現(xiàn)在ZT18的雄蛹頭部和ZT15的雌蛹頭部。進一步分析發(fā)現(xiàn)，除ZT3外，Gmper表達量在雄蛹頭部的表達量均極顯著高于對應(yīng)時間點的雌蛹頭部(t0=12.681,P0=0.0002;t3=4.051,P3=0.015;t6=11.99,P6=0.0003;t9=12.812,P9=0.0002;t12=16.661,P12=0.00008;t15=20.216,P15=0.00004;t18=9.941,P18=0.008;t21=15.235,P21=0.004) (圖6: A)；除ZT3和ZT12外，Gmtim在雄蛹頭部的表達量極顯著高于對應(yīng)時間點的雌蛹頭部(t0=11.328,P0=0.0003;t3=2.267,P3=0.086;t6=6.715,P6=0.003;t9=18.527,P9=0.00005;t12=0.074,P12=0.945;t15=4.628,P15=0.01;t18=17.299,P18=0.00007;t21=10.037,P21=0.006) (圖6: B)。

圖6 Gmper(A)和Gmtim(B)在梨小食心蟲蛹頭部的日表達模式Fig. 6 Daily expression patterns of Gmper (A) and Gmtim (B) in the head of Grapholita molesta pupae ZT: 授時時間Zeitgeber time; ZT0-ZT14: 光期Photophase; ZT14-ZT24: 暗期Scotophase. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；圖上雙星號表示雌雄間基因表達量差異極顯著(P<0.01, 獨立樣本T檢驗)。Data in theFigure are mean±SE. Double asterisk represents extremely significant difference in the gene expression level between male and female (P<0.01, independent samples T-test).

2.3 RNAi對梨小食心蟲羽化節(jié)律的影響

qPCR結(jié)果顯示，注射siRNA可以顯著降低Gmper和Gmtim在梨小食心蟲蛹體內(nèi)的表達水平。其中，雄蛹在注射Gmper-siRNA后，per在48 h和72 h呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢(tper-24h=0.540,Pper-24h=0.618;tper-48h=10.498,Pper-48h=0.0005;tper-72h=12.16,Pper-72h=0.0003)(圖7: A)；注射Gmtim-siRNA后24-72 h均表現(xiàn)出目的基因的極顯著下調(diào)(ttim-24h=24.882,Ptim-24h=0.00001;ttim-48h=19.557,Ptim-48h=0.00004;ttim-72h=17.632,Ptim-72h=0.00006) (圖7: C)。

雌蛹在注射Gmper-siRNA后，per在24-72 h呈現(xiàn)極顯著下調(diào)趨勢(tper-24h=15.438,Pper-24h=0.0001;tper-48h=7.334,Pper-48h=0.002;tper-72h=5.930,Pper-72h=0.004) (圖7: B); 而注射Gmtim-siRNA后24和72 h均表現(xiàn)出目的基因的極顯著下調(diào)(ttim-24h=16.721,Ptim-24h=0.0001;ttim-72h=26.42,Ptim-72h=0.0001) (圖7: D)。

圖7 梨小食心蟲蛹體內(nèi)Gmper (A, B)和Gmtim (C, D)的siRNA基因干涉效率Fig. 7 Interference efficiency of Gmper (A, B) and Gmtim (C, D) siRNA in Grapholita molesta pupae A, C: 雄蛹Male pupa; B, D: 雌蛹Female pupa. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號和雙星號分別表示基因表達量在siRNA處理組與對照組(NC)間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(獨立樣本T檢驗)。Data in theFigure are mean±SE. Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, in the gene expression level between the siRNA treatment group and the control group (NC)(independent samples T-test).

成蟲羽化率監(jiān)測結(jié)果表明，Gmper干涉處理組與對照組試蟲的羽化節(jié)律呈現(xiàn)出相似的趨勢，但對照組羽化高峰時間更加集中(ZT0)，而處理組呈現(xiàn)出兩個明顯的羽化高峰時間(ZT0和ZT2)，在ZT0時處理組羽化率顯著低于對照組(t=2.616,P=0.045)(圖8: A)。類似地，Gmtim干涉處理后，對照和處理組試蟲羽化高峰仍然集中出現(xiàn)在ZT0時，但干涉處理組羽化高峰期的成蟲羽化率顯著低于對照組試蟲(t=2.998,P=0.040) (圖8: B)，干涉處理組試蟲羽化時間也較對照組更加分散，但對Gmper和Gmtim進行干涉后對試蟲整體羽化率沒有顯著性影響(tper=1.457,Pper=0.219;ttim=1.251,Ptim=0.279) (圖8: C)。

圖8 分別RNAi干擾Gmper (A)和Gmtim (B)對梨小食心蟲羽化節(jié)律以及總體羽化率(C)的影響Fig. 8 Effect of the RNAi-based Gmper (A) and Gmtim (B) silencing on the emergence rhythm and overall emergence rate (C) of Grapholita molesta ZT: 授時時間Zeitgeber time; ZT0-ZT14: 光期Photophase; ZT14-ZT24: 暗期Scotophase. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上ns表示siRNA處理組和對照組(NC)間無顯著性差異(P>0.05, 獨立樣本T檢驗)；星號和雙星號分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(獨立樣本T檢驗)。Data in theFigure are mean±SE. ns above bars represents no significant difference between the siRNA treatment group and the control group (NC) (P>0.05, independent samples T-test), and the asterisk and double asterisk represent significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively by independent samples T-test.

3 討論

本研究通過基因克隆、序列分析、基因表達量測定及基于RNAi的基因功能研究，初步分析了梨小食心蟲Gmper和Gmtim的組織和時間表達模式及對成蟲羽化節(jié)律的調(diào)控作用。序列分析結(jié)果顯示，GmPER蛋白含有2個PAS結(jié)構(gòu)域和1個PAC結(jié)構(gòu)域。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，GmPER和GmTIM均分別與鱗翅目昆蟲的PER和TIM聚為一支(圖3和4)，但與昆蟲間親緣關(guān)系的一致性有差異，部分進化樹上很多節(jié)點的支持值較小，一方面這可能是由于兩個基因處于較為活躍的進化中，另外，鑒于已報道的昆蟲per和tim基因的全序列較少，分析樣本不足可能也會影響其準(zhǔn)確性。在后續(xù)獲得較多的全長基因序列后進行進一步比對，會得到更為可靠的分析結(jié)果。

在果蠅研究中，PAS (Per-Arnt-Stim)功能域，可以作為一個開關(guān)進行PER蛋白和TIM蛋白的結(jié)合調(diào)控(Yildizetal., 2005; Kingetal., 2011)。另外PAS+PAC結(jié)構(gòu)域可以充當(dāng)光傳感器功能，接受外界環(huán)境光信號進而調(diào)控一系列下游回路(Ponting and Aravind, 1997)。TIM是一種酸性蛋白質(zhì)，不僅在周期節(jié)律中起到核心因子的作用，在生物發(fā)育中也有重要作用。如在哺乳動物中，tim的缺失可導(dǎo)致上皮組織發(fā)育畸形，胚胎死亡率升高，近年來學(xué)者更是在其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)報功能上投入大量研究力量(宋何煜等, 2014)。蛋白激酶基因產(chǎn)物DBT對PER的穩(wěn)定性具有負調(diào)控作用，同時也可以介導(dǎo)磷酸化后的PER與TIM結(jié)合形成穩(wěn)定二聚體。在果蠅中PER/TIM復(fù)合體可抑制CYC和CLK的轉(zhuǎn)錄，CRY經(jīng)光誘導(dǎo)后作用于TIM使其降解，自此PER/TIM復(fù)合體降解，CYC和CLK的新一輪轉(zhuǎn)錄啟動(Ashmore and Sehgal, 2003)。因此，per和tim在昆蟲體內(nèi)作為重要的生物鐘反饋途徑元件保證了生物體一天24 h的行為活動節(jié)律。

基因表達水平檢測表明，梨小食心蟲雌雄成蟲中，Gmper和Gmtim的表達水平均在頭部最高(圖5)。在果蠅中，生物鐘可分為中樞生物鐘和外周生物鐘，中樞生物鐘被定位于頭部，梨小食心蟲體內(nèi)Gmper和Gmtim在頭部的高表達說明兩基因也在中樞生物鐘中發(fā)揮更重要的調(diào)控作用，若要進一步探究其調(diào)節(jié)中樞可再從腦部、觸角、復(fù)眼等結(jié)構(gòu)進行更細致的表達分析。蛹頭部Gmper和Gmtim的表達峰值均出現(xiàn)在暗期，在光期呈現(xiàn)表達水平低谷，且雄蛹中的表達水平顯著高于雌蛹(圖6)，說明蛹期兩基因的表達具有一定的晝夜節(jié)律性但同時存在一定的性別差異。兩基因在夜間的大量表達與果蠅中tim和per的消長規(guī)律較為吻合(Tataroglu and Emery, 2014)。由于梨小食心蟲的羽化高峰出現(xiàn)在凌晨，因此推測，蛹期生物鐘基因在夜間的高表達可能對次日黎明的羽化有重要調(diào)控作用。果蠅的相關(guān)研究結(jié)果也表明，羽化節(jié)律的準(zhǔn)確性依賴于晝夜節(jié)律調(diào)控作用的加強(Varmaetal., 2019)。雖然光照對蛹期Gmper和Gmtim的表達有顯著的抑制效果，但昆蟲各個時期對光的敏感性可能存在差異，如在家蠶中發(fā)現(xiàn)卵孵化期給予的光周期、溫度變化對幼蟲至蠶蛾期的per和tim表達無顯著性影響(宋艷, 2009)。在鱗翅目昆蟲中，per的作用和該基因在晝夜節(jié)律中的負反饋作用存在爭議，但近年來通過基因敲除技術(shù)對家蠶的研究發(fā)現(xiàn)，敲除per的試蟲出現(xiàn)羽化規(guī)律紊亂現(xiàn)象(Ikedaetal., 2019)，這為進一步探索per在鱗翅目昆蟲晝夜節(jié)律調(diào)控中發(fā)揮的作用提供了基礎(chǔ)和方向。在梨小食心蟲中，雌蛹Gmper和Gmtim的表達高峰期較雄蟲略有提前(圖6)，猜測可能與雌蟲的卵巢發(fā)育、交尾行為等有關(guān)。在哺乳動物中，確有大量數(shù)據(jù)表明per的缺失會導(dǎo)致卵巢發(fā)育受阻和產(chǎn)仔量下降(李瑞文, 2013; 劉超, 2015)。在昆蟲中，per,tim和dbt等生物鐘基因的缺失對于昆蟲的卵泡發(fā)育、產(chǎn)卵行為、卵孵化率等都具有較大影響。如在果蠅中，per和tim的缺失會導(dǎo)致果蠅中成熟卵母細胞數(shù)量下降，而雌蟲的產(chǎn)卵量可下降近50%(Beaveretal.，2003)。在雙斑蟋Gryllusbimaculatus中tim2基因缺失后除了影響試蟲的活動節(jié)律之外，卵巢中卵母細胞的數(shù)量會大大下降，且卵孵化率下降至2%以下(Noseetal., 2017)，因此生物鐘基因?qū)ι诚到y(tǒng)影響的探究極具研究潛力，可作為后續(xù)深入全面探究的切入點。面對諸多未探明的結(jié)果，昆蟲全發(fā)育期的系統(tǒng)表達模式分析可為更加細致的探究per和tim的調(diào)控作用機制提供更多的參考信息。

Gmtim和Gmper的基因表達干涉對梨小食心蟲的羽化節(jié)律有顯著影響。與對照相比，處理組節(jié)律性明顯減弱，表現(xiàn)出羽化時間點更加分散、羽化高峰期的羽化率顯著低于對照的現(xiàn)象(圖8: A, B)。果蠅的研究表明tim缺失型果蠅突變體timmutant的活動節(jié)律出現(xiàn)紊亂，但其羽化規(guī)律沒有改變(Wülbecketal., 2005)。但麻蠅Sarcophagacrassipalpis的研究發(fā)現(xiàn)，per基因在溫度影響羽化節(jié)律的過程中起到極其重要的調(diào)控作用。類似地，蔥蠅Deliaantiqua的研究表明，溫度改變可導(dǎo)致昆蟲羽化時間和生物鐘基因表達出現(xiàn)一致的改變。這些結(jié)果都說明，生物鐘基因在某些種類昆蟲的羽化過程發(fā)揮著重要作用 (Miyazakietal., 2016; Shortetal., 2016)。然而，不同物種的生活環(huán)境、生物學(xué)習(xí)性不同，因此種間的生物鐘基因種類、表達模式和調(diào)控機制等均可能存在差異。隨著更多相關(guān)研究，尤其是受物候變化影響巨大的農(nóng)林害蟲的相關(guān)研究進展的報道，將為我們進一步理解生物鐘對昆蟲羽化節(jié)律的調(diào)控作用提供更多參考，并可能為開發(fā)基于發(fā)育和行為節(jié)律調(diào)控的害蟲防控方法提供新思路或新靶標(biāo)。