蘇州地區(qū)初發(fā)克羅恩病患者糞便真菌菌群結(jié)構(gòu)研究*

尹 娟 胡 彤 徐麗娟 張麗平 葉玉蘭 龐 智1,&

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院北區(qū) 消化系疾病與營(yíng)養(yǎng)研究中心1(215008) 消化內(nèi)科2

背景：克羅恩病(CD)的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，研究表明腸道微生物在其中起重要作用。目的：研究蘇州地區(qū)CD患者糞便真菌菌群結(jié)構(gòu)變化及其與疾病間的關(guān)聯(lián)。方法：納入蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者23例和健康對(duì)照者18例，采集糞便樣本提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS1片段構(gòu)建克隆文庫(kù)，HiSeq平臺(tái)測(cè)序，基于OTU行樣本物種多樣性分析和組間物種差異分析，并進(jìn)一步分析在CD患者中豐度上調(diào)的真菌與炎性指標(biāo)CRP、ESR、糞便鈣衛(wèi)蛋白和CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)的相關(guān)性。結(jié)果：CD患者糞便樣本中的真菌物種多樣性顯著小于健康人。從門、綱、目、科、屬、種各水平分析，CD患者糞便中豐度顯著上調(diào)的真菌為酵母綱(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、位置未定科(Incertae_sedis)、念珠菌屬(Candida)、白念珠菌(Candida albicans)，新增真菌為絲孢酵母目(Trichosporonales)、絲孢酵母科(Trichosporonaceae)，豐度顯著下調(diào)的真菌為節(jié)擔(dān)菌綱(Wallemiomycetes)，缺失真菌為球囊菌門(Glomeromycota)、球囊菌綱(Glomeromycetes)、球囊霉科(Glomeraceae)、路德酵母屬(Lodderomyces)、中間念珠菌(Candida intermedia)、念珠菌(Candida sp)。CD患者糞便白念珠菌豐度與糞便鈣衛(wèi)蛋白呈顯著正相關(guān)(r=0.557,P=0.031)。結(jié)論：CD患者腸道真菌菌群與健康人相比發(fā)生顯著結(jié)構(gòu)變化，真菌物種多樣性減小，條件致病真菌如白念珠菌豐度增加，可能參與了疾病進(jìn)程。

克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的常見類型之一，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。既往研究表明，腸道微生物(包括細(xì)菌、真菌和病毒)在IBD發(fā)病中起重要作用[1-9]。隨著16S宏基因組測(cè)序的二代測(cè)序技術(shù)在腸道微生態(tài)研究中的普遍應(yīng)用，近年對(duì)IBD腸道菌群的研究日益深入。因真菌培養(yǎng)和針對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)測(cè)序存在技術(shù)難點(diǎn)以及數(shù)據(jù)庫(kù)不完善，目前國(guó)、內(nèi)外分析CD患者腸道真菌菌群譜的研究報(bào)道較少[8]。且因地域、采樣和研究方法不同，不同研究間結(jié)果存在較大差異[9]。Ott等[10]和Li等[11]的研究表明CD患者腸黏膜組織和糞便樣本中的真菌多樣性增加，Hoarau等[12]發(fā)現(xiàn)CD患者糞便樣本中的真菌多樣性降低，Sokol等[13]和Liguori等[14]分別對(duì)CD患者的糞便樣本和腸黏膜組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其真菌多樣性與健康對(duì)照者相比無(wú)明顯變化?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，CD患者存在豐度差異的真菌種類也不盡一致，如在糞便樣本中，Li等[11]發(fā)現(xiàn)白念珠菌(C.albicans)、新型隱球菌(C.neoformans)增加，Hoarau等[12]等發(fā)現(xiàn)熱帶念珠菌(C.tropicalis)增加，Sokol等[13]發(fā)現(xiàn)白念珠菌增加、釀酒酵母(S.cerevisiae)減少。為此，本研究收集江蘇省蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者的糞便樣本行ITS1測(cè)序分析，探討該地區(qū)CD患者真菌菌群結(jié)構(gòu)變化及其與疾病間的關(guān)聯(lián)。

材料與方法

一、臨床樣本采集

2018年5月—2019年8月蘇州市立醫(yī)院北區(qū)消化內(nèi)科初發(fā)CD患者23例和健康體檢者18例納入研究。入選者均無(wú)慢性疾病，就診前1個(gè)月內(nèi)無(wú)用藥記錄。CD患者診斷符合我國(guó)IBD診治共識(shí)，剔除急性腸炎和腸易激綜合征。于排便后1 h內(nèi)采集糞便樣本5 g，按0.2 g/份進(jìn)行分裝，過液氮后-80 ℃冰箱保存。研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[南醫(yī)大倫審(2017)277號(hào)]，并取得所有受檢者的知情同意。

二、真菌特異性ITS1區(qū)克隆文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序分析

使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)抽提糞便樣本基因組DNA，取質(zhì)量合格的樣品30 ng和ITS1區(qū)對(duì)應(yīng)的融合引物配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，行PCR擴(kuò)增。使用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒(Beckman Coulter)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液中，貼上標(biāo)簽，完成建庫(kù)。使用生物芯片分析系統(tǒng)(Agilent 2100 Bioanalyzer)檢測(cè)文庫(kù)片段范圍和濃度，經(jīng)檢測(cè)合格的文庫(kù)根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。本步驟中的糞便樣本基因組DNA提取和HiSeq測(cè)序由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.多樣性分析：使用Mothur軟件分析樣品alpha多樣性。

2.聚類分析：使用phytools軟件和R語(yǔ)言(v3.5.1)，根據(jù)Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離矩陣做UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類分析。對(duì)OTU(operational taxonomic unit)進(jìn)行物種分類，使用R語(yǔ)言(v3.5.1)在種水平對(duì)各樣品作物種豐度柱狀圖(豐度在所有樣品中均低于0.5%的物種合并為others)。將聚類結(jié)果與各樣品物種相對(duì)豐度整合，直觀展示樣品的物種組成及其差異情況。

3.差異分析：使用R語(yǔ)言(v3.1.1)Venn-Diagram包繪制OTU Venn圖；使用R語(yǔ)言(v3.2.1)mixOmics包繪制OTU PLS-DA(partial least squares discrimination analysis)圖；使用R語(yǔ)言(v3.4.1)繪制兩組Top 10豐度OTU差異比較柱狀圖；使用R語(yǔ)言(v3.4.1)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，分析組間物種豐度差異，計(jì)算P值和FDA(false discovery rate)值。

4.相關(guān)性分析：使用GraphPad Prism軟件分析CD組豐度差異真菌白念珠菌的測(cè)序豐度與C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、糞便鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin,CALP)和CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)之間的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、一般資料

蘇州地區(qū)23例初發(fā)CD患者的CDAI均值為175.2，兩組受檢者具體臨床信息見表1。

表1 CD患者和健康對(duì)照者臨床信息

二、CD患者糞便樣本中真菌物種多樣性(species diversity)小于健康對(duì)照者

對(duì)23例初發(fā)CD患者和18例健康對(duì)照者糞便樣本基因組DNA真菌特異性ITS1區(qū)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，質(zhì)控OTU累積曲線末端上升趨勢(shì)趨于平緩，表明采樣量足夠，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)具有代表性。對(duì)兩組中能與OTU代表序列比對(duì)且OTU具有注釋結(jié)果的tags總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CD組tags總數(shù)(真菌總量)均值高于健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(41 103對(duì)33 382,P=0.151 4)。

分析兩組單個(gè)樣品中的物種多樣性，shannon指數(shù)(P=0.004 7)和simpson指數(shù)(P=0.004 3)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CD組糞便樣本中的真菌物種多樣性顯著小于健康對(duì)照組；兩組Good coverage值均接近1，表明樣品中序列未被測(cè)出的概率低(圖1、表2)。

由下至上5條線分別為最小值、下四分位數(shù)、中位數(shù)、上四分位數(shù)和最大值，異常值以“?”表示圖1 CD患者和健康對(duì)照者糞便樣本單個(gè)樣品真菌物種多樣性分析(alpha多樣性箱型圖)

表2 CD患者和健康對(duì)照者糞便樣本真菌物種多樣性alpha多樣性指數(shù)比較

對(duì)糞便樣本真菌種水平的UPGMA聚類分析和豐度分析直觀展示了所有測(cè)序樣品的真菌物種組成及其差異情況，結(jié)果同樣表明CD組真菌物種多樣性更低，且在聚類圖中部有聚集(圖2)。

左圖為UPGMA聚類樹結(jié)果，右圖為物種豐度柱狀圖樣品越靠近，枝長(zhǎng)越短，表明兩個(gè)樣品的物種組成越相似圖2 UPGMA聚類樹與豐度組合圖

三、CD患者糞便樣本差異真菌分析

OTU Venn圖結(jié)果顯示CD組糞便樣本中真菌OTU數(shù)目小于健康對(duì)照組(122對(duì)149)，共有OTU數(shù)為57個(gè)。OTU PLS-DA分析結(jié)果表明根據(jù)OTU豐度差異可將CD患者和健康對(duì)照者區(qū)分為兩群(圖3A)。Top10豐度OTU差異比較柱狀圖表明兩組豐度前10的OTU中有兩個(gè)(OTU15和OTU177)存在顯著差異(圖3B)，種水平上分別可注釋到似平滑念珠菌(C.metapsilosis)和白念珠菌。種水平的物種豐度差異分析發(fā)現(xiàn)CD組白念珠菌顯著增多，中間念珠菌(C.intermedia)缺失(圖4)。

A：OTU PLS-DA圖(橫、縱坐標(biāo)軸刻度為相對(duì)距離，無(wú)實(shí)際意義)；B：Top10豐度OTU差異比較柱狀圖(*兩組間比較，P<0.05)圖3 CD患者和健康對(duì)照者OTU PLS-DA圖和Top10豐度OTU差異比較柱狀圖

左圖為兩組物種相對(duì)豐度柱狀圖；中間為同一物種在兩組中平均相對(duì)豐度比值(健康對(duì)照/CD)的log2值；右圖為Wilcoxon秩和檢驗(yàn)P值和FDR值圖4 CD患者和健康對(duì)照者糞便樣本真菌物種豐度差異Wilcox秩和檢驗(yàn)結(jié)果

從門、綱、目、科、屬、種水平綜合分析兩組間測(cè)序豐度存在顯著差異的真菌，CD組糞便樣本中豐度顯著上調(diào)的真菌為酵母綱(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、位置未定科(Incertae_sedis)、念珠菌屬(Candida)、白念珠菌，新增真菌為絲孢酵母目(Trichosporonales)、絲孢酵母科(Trichosporonaceae)，豐度顯著下調(diào)的真菌為節(jié)擔(dān)菌綱(Wallemiomycetes)，缺失真菌為球囊菌門(Glo-meromycota)、球囊菌綱(Glomeromycetes)、球囊霉科(Glomeraceae)、路德酵母屬(Lodderomyces)、中間念珠菌、念珠菌(Candidasp)(表3)。

表3 CD患者糞便樣本豐度差異真菌

四、CD患者糞便樣本白念珠菌豐度與CALP呈正相關(guān)

相關(guān)性分析顯示，CD患者糞便樣本中豐度顯著上調(diào)的白念珠菌與CRP、ESR、CDAI無(wú)明顯相關(guān)性，與糞便CALP呈顯著正相關(guān)(r=0.557 0,P=0.031 0；圖5)。

圖5 CD患者糞便樣本白念珠菌豐度與CRP、ESR、糞便CALP和CDAI的相關(guān)性分析

討 論

人體內(nèi)的真菌菌群紊亂與平衡呈動(dòng)態(tài)過程，是塑造機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[15]。共生真菌如白念珠菌、釀酒酵母等可能在馴化宿主免疫系統(tǒng)，從而更有效地對(duì)抗病原微生物方面起重要作用[16]。CD和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是IBD最常見的兩種類型，且發(fā)病機(jī)制不明。目前國(guó)、內(nèi)外越來(lái)越多的研究證據(jù)表明真菌在IBD中起有免疫調(diào)節(jié)作用，人體免疫系統(tǒng)與真菌之間相互作用的改變可能參與了IBD的發(fā)病過程。Dectin-1和CARD9分別為真菌β-葡聚糖受體和抗真菌受體的下游基因[15]。Iliev等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，C型凝集素受體Dectin-1缺失可使小鼠對(duì)共生真菌的免疫應(yīng)答發(fā)生改變，從而對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎易感；UC患者的Dectin-1基因多態(tài)性與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)CARD9 與IBD易感性相關(guān)[18-19]。早年研究[20]也發(fā)現(xiàn)血清抗釀酒酵母抗體可作為CD診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。因此，研究CD患者腸道真菌豐度改變及其與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，對(duì)于探討CD發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者糞便樣本中的真菌菌群結(jié)構(gòu)與健康對(duì)照者相比有顯著差異，真菌總量略有升高，但與健康對(duì)照者間差異不顯著；CD患者糞便真菌物種多樣性減小，在門、綱、目、科、屬、種各水平均與健康對(duì)照者存在顯著差異。分析顯示CD患者糞便樣本中白念珠菌豐度顯著增加，與國(guó)外多數(shù)研究結(jié)果一致[11,13]。白念珠菌作為腸道共生真菌，在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是維持機(jī)體對(duì)黏膜部位抗原的抗炎與促炎免疫反應(yīng)平衡的核心?；顒?dòng)期CD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例低于非活動(dòng)期CD患者，存在機(jī)體免疫抑制功能失調(diào)[21]。有研究[22]發(fā)現(xiàn)健康人外周血中含有大量針對(duì)共生白念珠菌的抗原特異性Treg細(xì)胞。據(jù)此推測(cè)，CD患者腸道中白念珠菌豐度增加，可能導(dǎo)致外周血白念珠菌特異性Treg細(xì)胞增加，抑制腸黏膜對(duì)白念珠菌的免疫反應(yīng)。此種抑制作用可能使共生白念珠菌有機(jī)會(huì)在腸道內(nèi)進(jìn)一步增殖，打破腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)平衡，使真菌物種多樣性降低。繼而在CD后期，白念珠菌可能作為條件致病真菌引發(fā)真菌感染。目前IBD疾病本身和(或)治療藥物相關(guān)真菌感染已成為臨床醫(yī)師關(guān)注的熱點(diǎn)問題[23]。此外，還需結(jié)合CD患者的基因多態(tài)性情況進(jìn)行推測(cè)?；颊叩恼婢庖呦嚓P(guān)基因如Dectin-1、CARD9等的多態(tài)性或突變可致真菌與宿主間的免疫作用異常，使人體不能抑制白念珠菌等條件致病真菌增殖及其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

近期國(guó)、內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在IBD發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用[24-26]?；顒?dòng)期CD和UC患者腸黏膜組織和外周血CD177+中性粒細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照者；與CD177-中性粒細(xì)胞相比，CD177+中性粒細(xì)胞分泌較低水平的促炎細(xì)胞因子如干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-17A，同時(shí)分泌較高水平的IL-22和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，抗菌活性增強(qiáng)[24-25]。中性粒細(xì)胞是抵抗真菌感染最主要的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，其抗真菌機(jī)制主要包括吞噬真菌、通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧、釋放抗菌顆粒以及形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps)[27]。中性粒細(xì)胞分泌的CALP亦有抗微生物感染作用。條件致病真菌白念珠菌的菌絲形態(tài)與其侵襲組織和引發(fā)感染的致病潛能相關(guān)，此種菌絲形態(tài)可觸發(fā)中性粒細(xì)胞的遷移活性，進(jìn)而殺傷白念珠菌[28]。本研究進(jìn)一步分析了白念珠菌與CD患者中性粒細(xì)胞之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)患者糞便樣本中的CALP濃度與白念珠菌豐度呈顯著正相關(guān)。由此推測(cè)白念珠菌在CD中可能起促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用，如促進(jìn)CALP分泌。本研究未發(fā)現(xiàn)白念珠菌豐度與炎性指標(biāo)ESR、CRP和反映病情嚴(yán)重程度的CDAI之間存在相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，本研究分析了蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者的糞便真菌菌群結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)患者腸道真菌菌群與健康人相比發(fā)生顯著結(jié)構(gòu)變化，真菌生物多樣性減小，條件致病真菌如白念珠菌豐度增加，可能參與了疾病進(jìn)程。研究具有一定地域特色，可為CD臨床診療以及相關(guān)機(jī)制研究提供參考數(shù)據(jù)。本研究的局限性主要包括：樣本量偏小，可能因采樣因素造成統(tǒng)計(jì)誤差；未設(shè)置UC對(duì)照組，未能明確特定真菌豐度變化是否為CD特異性。此外，腸道微生態(tài)中的細(xì)菌與真菌之間存在相互影響，如能對(duì)糞便樣本同時(shí)進(jìn)行16S測(cè)序，對(duì)分析細(xì)菌與真菌在CD中的相互作用具有重要意義。因此，本課題組后續(xù)擬擴(kuò)大CD患者糞便樣本量，同時(shí)收集UC、普通腸炎和腸易激綜合征患者的糞便樣本，同時(shí)行ITS和16S測(cè)序，從而更深入地研究CD患者腸道真菌菌群在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。