宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其Wnt/β-catenin信號(hào)通路機(jī)制

劉 晶，王 景，葛 靜，馮艷萍，房桂英，王 旭，楊艷紅，李 林

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050031)

宮頸癌患者治療失敗及預(yù)后比較差的主要原因?yàn)閷m頸癌的轉(zhuǎn)移，但其侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不十分清楚。外泌體為一種雙層膜包裹的小囊泡，在生理和病理?xiàng)l件下由細(xì)胞釋放到胞外[1]。研究[2-3]顯示：外泌體攜帶包括mRNA、DNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)、微小 RNA(microRNAs)、脂質(zhì)和蛋白等一系列生物活性物質(zhì)，在惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和化療耐藥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。宮頸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體也受到大家關(guān)注，易紅艷等[4]通過(guò)差速超速離心法分離出宮頸癌Siha細(xì)胞 外泌體，并發(fā)現(xiàn)Siha細(xì)胞外泌體可介導(dǎo)癌前細(xì)胞Ect1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高其侵襲能力。但宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體對(duì)其侵襲遷移的影響及可能機(jī)制尚未完全清楚。本文作者通過(guò)分離宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體，觀察其對(duì)HeLa細(xì)胞遷移、侵襲及Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路的影響，探討宮頸癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人宮頸癌HeLa細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫(kù))。FKH-26染劑和胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，兔抗人CD63抗體、兔抗人CD81抗體、兔抗人Wnt1抗體、兔抗人β-catenin抗體和兔抗人T細(xì)胞因子4(T cell factor 4,TCF4)抗體(美國(guó)Abcam公司)。共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)。

1.2 無(wú)外泌體血清制備和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)將Hyclone胎牛血清100 000 g離心70 min，去除沉淀得到無(wú)外泌體胎牛血清。將HeLa細(xì)胞用無(wú)外泌體的胎牛血清配置的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。

1.3 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外泌體的收集將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用無(wú)外泌體的胎牛血清配置的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)48 h，收集HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清，500 g離心10 min，再12 000 g離心20 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm孔濾器過(guò)濾，過(guò)濾后100 000 g離心2 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)液重懸沉淀，100 000 g離心2 h，沉淀用PBS液重懸即為HeLa細(xì)胞外泌體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電鏡下觀察外泌體形態(tài)表現(xiàn)將上述獲得的沉淀用PBS(含2%多聚甲醛)重懸，吸取適量重懸液滴加到電鏡用銅網(wǎng)上，干燥30 min，PBS液清洗，加入1%戊二醛固定5 min，蒸餾水沖洗，用0.4%醋酸雙氧鈾染色5 min，醋酸雙氧鈾和甲基纖維素混合物染色并包被10 min，晾10 min，透射電鏡下拍照并觀察外泌體形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 Western blottig檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81蛋白表達(dá)情況取20 μL重懸的上述外泌體，加入蛋白裂解液10 μL，冰上裂解30 min，12 000 g離心20 min，收集上清液即為外泌體蛋白。取80 μg外泌體蛋白經(jīng)電泳2 h，半干法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入相應(yīng)一抗(兔抗人CD63抗體、兔抗人CD81抗體，稀釋比例1∶1 000)，過(guò)夜孵育，以β-actin為內(nèi)參。加入二抗孵育1 h，ECL顯色，暗室曝光顯影，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，凝膠成像系統(tǒng)獲得蛋白條帶圖片，采用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。

1.6 HeLa細(xì)胞攝取外泌體實(shí)驗(yàn)PKH-26為膜標(biāo)記染料，可與外泌體脂膜結(jié)合并發(fā)出紅色熒光，可用于外泌體存在的鑒定。將1 μL PKH-26染料與100 μL外泌體孵育，加入1 mL Diluent C，加入200 μL 1% BSA/PBS，再加入3 μL PKH-26染料孵育20 min，100 000 g離心70 min，獲得標(biāo)記好的外泌體沉淀。將HeLa細(xì)胞置于12孔板中培養(yǎng)，達(dá)70%融合時(shí)更換為含標(biāo)記好的外泌體的新鮮培養(yǎng)基孵育24 h，PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，DAPI染色細(xì)胞核，共聚焦熒光顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞攝取外泌體情況。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力用Matrigal膠包被Transwell小室上室。用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)HeLa細(xì)胞12 h，用胰蛋白酶消化細(xì)胞， 1 000 g離心5 min，PBS清洗，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸HeLa細(xì)胞，調(diào)整HeLa細(xì)胞密度為1 × 105mL-1，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，并設(shè)外泌體組(Exo組)和對(duì)照組，Exo組細(xì)胞中加入20 μL外泌體懸液，對(duì)照組細(xì)胞中加入20 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。小室的下室加入去除外泌體的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棉簽擦去基質(zhì)膠及上室細(xì)胞，PBS沖洗，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)，代表細(xì)胞遷移能力。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力在12孔板背后用記號(hào)筆均勻劃3條平行橫線，橫線橫穿過(guò)孔，間隔0.8 cm。調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞密度為1 × 105mL-1，在12孔板中加入HeLa細(xì)胞過(guò)夜孵育，24 h后用10 μL槍頭垂直背后橫線垂直劃痕，PBS沖洗去除劃下細(xì)胞，細(xì)胞分為Exo組和對(duì)照組，Exo組細(xì)胞總加入含外泌體懸液50 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞加入等量無(wú)血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0 h和24 h拍照觀察細(xì)胞遷移距離，代表細(xì)胞遷移能力。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。

1.9 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平將HeLa細(xì)胞分為Exo組和對(duì)照組，接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)80%以上融合時(shí)，更換培養(yǎng)基，Exo組細(xì)胞中加入含50 μL外泌體懸液的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入50 μL不含外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。24 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，以兔抗人Wnt1、兔抗人β-catenin和兔抗人TCF4抗體為一抗，稀釋比例為1∶1 000，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平，具體步驟見(jiàn)“1.6”。目的蛋白表達(dá)水平 = 目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 HeLa細(xì)胞來(lái)源外泌體鑒定透射電鏡下觀察：通過(guò)超速離心法獲得HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清中有呈圓形或橢圓形、直徑為40 ～ 100 nm的囊泡狀小體。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：囊泡狀小體中富含CD63蛋白和CD81蛋白，表明HeLa細(xì)胞中分離的物質(zhì)為外泌體。見(jiàn)圖1和圖2。

A: Bar = 100 nm; B: Bar = 25 nm.

2.2 HeLa細(xì)胞攝取外泌體情況HeLa細(xì)胞外泌體采用PKH26熒光標(biāo)記(PKH26染劑不影響外泌體特性，且可與外泌體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定結(jié)合發(fā)出紅色熒光)， HeLa細(xì)胞用DAPI熒光進(jìn)行核染色，培養(yǎng)24 h，共聚焦熒光顯微鏡觀察，對(duì)照組HeLa細(xì)胞膜表面無(wú)標(biāo)記外泌體附著，Exo組HeLa細(xì)胞膜表面有標(biāo)記的外泌體附著。見(jiàn)圖3(插頁(yè)七)。

Lane 1：Control group；Lane 2：Exo group.

2.3 2組HeLa細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較， Exo組HeLa細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖4和表1。

A:Cotrol group; B:Exo group.

表1 2組HeLa細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移距離

2.4 2組HeLa細(xì)胞遷移距離與對(duì)照組比較，Exo組HeLa細(xì)胞遷移距離明顯增加(P<0.01)。見(jiàn)表1和圖5。

A,B:0 h； C,D:24 h;A,C:Control group; B,D:Exo group.

2.5 2組HeLa細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，Exo組HeLa細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表2和圖6。

表2 2組HeLa細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平

Lane 1：Control group；Lane 2：Exo group.

3 討 論

外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，直徑為50～140 nm，由細(xì)胞經(jīng)過(guò)內(nèi)吞、融合-外排等調(diào)控過(guò)程形成；外泌體通過(guò)攜帶蛋白質(zhì)、核酸等生物活性小分子在細(xì)胞之間進(jìn)行信號(hào)傳遞[5]。外泌體可從各種體液、細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分離，其功能和組成由其細(xì)胞來(lái)源決定[6]。外泌體在惡性腫瘤微環(huán)境中含量非常豐富，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。如腫瘤來(lái)源的外泌體增強(qiáng)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]，M2巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲[9]，食管癌細(xì)胞來(lái)源外泌

體促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[10]，胰腺癌外泌體促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。本研究采用超速離心法成功分離得到宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體，并發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞來(lái)源外泌體可促進(jìn)HeLa細(xì)胞本身侵襲和遷移能力，表明宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體在其自身侵襲和遷移過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。

為探討宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體在宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲和遷移中的作用機(jī)制，本文作者對(duì)HeLa細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游基因進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：宮頸癌HeLa細(xì)胞來(lái)源外泌體可升高HeLa細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，宮頸癌的侵襲遷移與Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)系密切[11-12]。β-catenin在細(xì)胞中以游離型和結(jié)合型兩種形式存在，結(jié)合型β-catenin通過(guò)與上皮鈣黏蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞之間的黏附；游離型β-catenin通過(guò)Wnt信號(hào)通路作用于惡性腫瘤細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(LEF/TCF)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13-14]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活機(jī)制比較復(fù)雜，在Wnt蛋白缺失的情況下，細(xì)胞中的β-catenin被磷酸化，磷酸化的β-catenin由蛋白酶降解，因此在細(xì)胞內(nèi)保持比較低的水平；在Wnt蛋白存在的條件下，β-catenin磷酸化水平低，導(dǎo)致胞內(nèi)β-catenin大量積累，隨后進(jìn)入細(xì)胞核中，可在細(xì)胞核中與LEF/TCF形成復(fù)合物，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，參與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過(guò)程[15-16]。TCF家族為Wnt信號(hào)通路的分子開(kāi)關(guān)，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，尤其是TCF4與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)[17-18]。在宮頸癌中Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活，Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)水平升高，其下游的TCF4蛋白表達(dá)水平也升高。外泌體可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用，如脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過(guò)Wnt /β-catenin信號(hào)通路保護(hù)心肌免受缺血/再灌注損傷[19]；缺氧結(jié)直腸癌細(xì)胞來(lái)源外來(lái)體通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)血管生成[20]；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)胃癌進(jìn)展[21]。本研究中宮頸癌HeLa細(xì)胞來(lái)源外泌體可升高HeLa細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平，表明宮頸癌HeLa細(xì)胞來(lái)源外泌體可能通過(guò)促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路及其下游的TCF4基因抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移過(guò)程。

綜上所述，宮頸癌HeLa細(xì)胞來(lái)源的外泌體可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能與HeLa細(xì)胞來(lái)源外泌體可促進(jìn)Wnt /β-catenin信號(hào)通路的激活及下游TCF4基因的表達(dá)有關(guān)。