質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定報(bào)陽血培養(yǎng)細(xì)菌可行性分析

王軍杰，馬 冰，李 軼，閆文娟，王山梅，馬 瓊，張江峰，許俊紅，袁有華

（1. 周口市鹿邑真源醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 周口 477200；2.河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450003）

血流感染（bloodstream infection，BSI）發(fā)展迅速、病死率高，是醫(yī)院最危重的感染之一[1]。血培養(yǎng)是BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于報(bào)陽的血培養(yǎng)，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告流程包括革蘭染色鏡檢、傳代分離培養(yǎng)、基于表型的生化鑒定和抗菌藥物體外藥物敏感性試驗(yàn)等步驟，出具報(bào)告需要48～72 h，且每延遲1 h均可能增加患者的病死率。如果病原菌生長(zhǎng)條件要求苛刻或生化惰性，則周期更長(zhǎng)。因此，對(duì)血培養(yǎng)報(bào)陽樣本的病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定顯得尤為重要[2]?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）無需進(jìn)行常規(guī)的革蘭染色、氧化酶、觸酶和生化反應(yīng)，數(shù)分鐘內(nèi)就可完成鑒定比對(duì)，操作簡(jiǎn)便、快速、通量高、成本低，是臨床微生物檢驗(yàn)革命性的發(fā)展。本研究擬采用MALDI-TOF MS直接對(duì)血培養(yǎng)陽性樣本進(jìn)行菌種鑒定，并同步進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)常規(guī)生化鑒定，比較2種方法結(jié)果的一致性，評(píng)估質(zhì)譜技術(shù)在BSI診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2018年7—9月河南省人民醫(yī)院臨床送檢的非重復(fù)報(bào)陽血培養(yǎng)443瓶。入選標(biāo)準(zhǔn)：全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)出陽性報(bào)警，經(jīng)常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：報(bào)陽培養(yǎng)物常規(guī)革蘭染色鏡檢結(jié)果為無細(xì)菌。同一患者同時(shí)或先后送檢多瓶血培養(yǎng)，取最先報(bào)陽的血培養(yǎng)，以避免重復(fù)。

1.2 儀器與試劑

BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)、需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶、Phoenix 100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及藥物敏感性試驗(yàn)板條（美國(guó)BD公司），Microflex LT/SH全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)、MSP96孔靶板和α-氰基-4-羥基肉桂酸（德國(guó)Bruker Daltonik公司），甲酸與乙腈（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），血平板、麥康凱平板和巧克力平板（鄭州安圖公司）。

1.3 常規(guī)生化鑒定

將陽性培養(yǎng)物同時(shí)轉(zhuǎn)種于血平板、巧克力平板和麥康凱平板，獲得純菌落后采用Phoenix 100全自動(dòng)生化鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定與體外藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)2018年相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.4 質(zhì)譜法鑒定

1.4.1 質(zhì)譜前處理 本研究團(tuán)隊(duì)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了幾種不同的樣本處理方法，優(yōu)化改良后制定了本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。從報(bào)陽血培養(yǎng)瓶中取出3.0 mL血液轉(zhuǎn)入3.5 mL血漿分離膠管，1 600×g離心10 min。棄上清，加1.0 mL去離子水重懸沉淀，轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf離心管中，12 000×g離心3 min，棄去上層的水和細(xì)胞。再次重懸沉淀于1 mL去離子水，12 000×g離心3 min，再次棄去上層的水和細(xì)胞，小心吸除上層液體保留白色菌膜。取1 μL用于質(zhì)譜分析。

1.4.2 質(zhì)譜分析 取1 μL樣本提取物點(diǎn)樣于96孔不銹鋼質(zhì)譜靶板，待干燥后再覆以1 μL 70%甲酸自然晾干。待干燥后再覆以1 μL基質(zhì)液（α-氰基-4-羥基肉桂酸）自然晾干。完全干燥后，將靶板放入Microflex LT/SH全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，輸入菌株信息，采集菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用Biotype 3.0軟件將人工采集到的圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜進(jìn)行比對(duì)和結(jié)果分析，鑒定菌種，記錄質(zhì)譜評(píng)分前2種非重復(fù)菌種的鑒定結(jié)果。分值≥2.000，判定為能有效鑒定至種水平；分值為1.700～2.000，判定為可有效鑒定至屬水平；分值<1.700，判定為鑒定結(jié)果不可靠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用FlexControl 3.0軟件、Biotype 3.0軟件、ChinProTool 3.0軟件（德國(guó)Bruker公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分布

排除7個(gè)假報(bào)陽血培養(yǎng)瓶，陽性培養(yǎng)物中共分離出436株細(xì)菌，其中革蘭陽性菌155株（35.6%）、革蘭陰性菌236株（54.1%）、真菌19株（4.4%）、厭氧菌12株（2.7%）、少見菌14株（3.2%），所有樣本均采用Microflex LT/SH全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。155株革蘭陽性菌中，有147株（94.8%）質(zhì)譜鑒定可信度分值≥1.700，115株（74.2%）鑒定可信度分值≥2.000。236株革蘭陰性菌中，有226株（95.8%）質(zhì)譜鑒定可信度分值≥1.700，173株（73.3%）鑒定可信度分值≥2.000。19株真菌中，有16株（84.2%）質(zhì)譜鑒定可信度分值≥1.700，5株（26.3%）鑒定可信度分值≥2.000。12株厭氧菌中，有9株（75.0%）質(zhì)譜鑒定可信度分值≥1.700，8株（66.7%）鑒定可信度分值≥2.000。14株少見菌中，有13株（92.9%）質(zhì)譜鑒定可信度分值≥1.700，7株（50.0%）鑒定可信度分值≥2.000。

2.2 革蘭陽性菌鑒定結(jié)果

155株革蘭陽性菌中，有127株（81.9%）2種方法鑒定結(jié)果一致。82.5%（85/103）的葡萄球菌屬鑒定結(jié)果一致，其中98株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)100%；78株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)85.9%（67/78）。66.7%（14/21）的鏈球菌屬2種方法鑒定結(jié)果一致，其中19株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)84.2%（16/19）；14株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)85.7%（12/14）。95.8%（23/24）的腸球菌屬鑒定結(jié)果一致，其中24株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)100%；19株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)94.7%（18/19）。71.4%（5/7）的陽性桿菌鑒定結(jié)果一致，其中6株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)71.4%（5/6）；4株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)100%。見表1。

表1 革蘭陽性菌2種方法鑒定結(jié)果比較

2.3 革蘭陰性菌鑒定結(jié)果

236株革蘭陰性菌中，有219株（92.8%）2種方法鑒定結(jié)果一致。93.2%（178/191）的腸桿菌科細(xì)菌鑒定結(jié)果一致，其中182株可信度分值≥1.700，鑒定一致率為98.4%（179/182）；140株可信度分值≥2.000，鑒定一致率為95.7%（134/140）。90.5%（38/42）的非發(fā)酵菌鑒定結(jié)果一致，其中41株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)97.6%（40/41）；30株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)93.3%（28/30）。3株其他革蘭陰性桿菌鑒定結(jié)果一致率達(dá)100%；見表2。

2.4 真菌鑒定結(jié)果

19株真菌中，有16株（84.2%）2種方法鑒定結(jié)果一致。其中16株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)93.8%（15/16）；5株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)80.0%（4/5）。見表3。

2.5 厭氧菌和少見菌鑒定結(jié)果

12株厭氧菌中，有8株（66.7%）2種方法鑒定結(jié)果一致；其中9株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)77.8%（7/9）；8株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)87.5%（7/8）。14株少見菌中，有8株（57.1%）2種方法鑒定結(jié)果一致；其中13株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達(dá)76.9%（10/13），7株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達(dá)85.7%（6/7）。見表4、表5。

表2 革蘭陰性菌2種方法鑒定結(jié)果比較

表3 真菌2種方法鑒定結(jié)果比較

表4 厭氧菌2種方法鑒定結(jié)果比較

表5 少見菌2種方法鑒定結(jié)果比較

3 討論

質(zhì)譜技術(shù)作為近些年發(fā)展起來的新技術(shù)，與傳統(tǒng)表型鑒定法相比，最大的優(yōu)勢(shì)在于可直接鑒定血培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌，從而節(jié)約再次分離培養(yǎng)鑒定的時(shí)間。本研究結(jié)果表明，質(zhì)譜技術(shù)鑒定細(xì)菌可信度分值≥2.000的細(xì)菌以革蘭陽性菌（74.2%）最多，以下依次是革蘭陰性菌（73.3%）、厭氧菌（66.7%）、少見菌（50.0%）、真菌（26.3%），且2種方法鑒定結(jié)果一致率也以革蘭陰性菌（92.8%）最高，以下依次為革蘭陽性菌（81.9%）、真菌（84.2%）、厭氧菌（66.7%）、少見菌（57.1%），與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果（質(zhì)譜對(duì)革蘭陰性菌鑒定準(zhǔn)確率高于革蘭陽性菌）[3]一致。在常見陽性菌，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、紋帶棒狀桿菌，尤其是屎腸球菌和糞腸球菌，以及常見陰性菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等的鑒定中，質(zhì)譜技術(shù)的準(zhǔn)確率很高[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在真菌（近平滑念珠菌、光滑念珠菌等）、厭氧菌（脆弱擬桿菌等）及少見菌（藤黃微球菌等）的鑒定中，質(zhì)譜技術(shù)與常規(guī)鑒定方法的結(jié)果有非常高的一致性。質(zhì)譜技術(shù)鑒定鏈球菌屬準(zhǔn)確率較低可能與緩癥鏈球菌不同種之間的相似性較高（如緩癥鏈球菌、血鏈球菌和口腔鏈球菌）[5]有關(guān)。葡萄球菌屬主要是區(qū)分金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，質(zhì)譜技術(shù)對(duì)二者的鑒別診斷較為準(zhǔn)確。從陽性血培養(yǎng)瓶中快速、準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌是質(zhì)譜技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)。本研究在2 h內(nèi)就能從陽性血培養(yǎng)瓶中得到種、屬水平的鑒定報(bào)告，對(duì)于BSI，尤其是重癥BSI患者來說意義重大。因此，在BSI診療中采用質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合醫(yī)院和地區(qū)的耐藥性檢測(cè)數(shù)據(jù)，可合理選擇抗感染治療方案，即能覆蓋可能的病原體，又可避免廣譜抗菌藥物的過度使用。

本研究仍存在不足之處，如由于樣本數(shù)量的原因，有些細(xì)菌僅有1次鑒定結(jié)果，可能無法得出準(zhǔn)確的結(jié)論，但本研究結(jié)果支持質(zhì)譜技術(shù)可直接準(zhǔn)確、快速地鑒定陽性血培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌這一結(jié)論。雖然樣本處理流程、血培養(yǎng)瓶類型、常見菌種分布差異等可能導(dǎo)致不同研究中結(jié)果的差異[6]，但采用質(zhì)譜技術(shù)可滿足臨床對(duì)BSI常見病原菌快速診斷的需求，可幫助臨床早期進(jìn)行合理的抗菌藥物治療，提高BSI患者的生存率，值得推廣。