基于高通量靶向測序的常見實體腫瘤基因突變圖譜研究

陳慧娟，王 景，王愛琴

（ 1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.北京博奧醫(yī)學檢驗所有限公司，北京 101111）

在全世界范圍內(nèi)，腫瘤依舊是發(fā)病率和致死率較高的疾病之一。據(jù)我國國家癌癥中心統(tǒng)計，2015年我國腫瘤新發(fā)病例392.9萬，發(fā)病率為285.83/10萬；死亡病例233.8萬例，死亡率為170.05/10萬[1]。在我國，腫瘤的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[2]，自2010年起腫瘤死亡率高居各類疾病首位[3]，已成為危害公眾健康的巨大殺手。近年來，隨著藥物基因組學的快速發(fā)展、各種腫瘤驅動基因的發(fā)現(xiàn)、各類靶向藥物和免疫治療藥物的“井噴式”出現(xiàn)，腫瘤的治療取得了較大進展，由原來的“一病同治”逐步實現(xiàn)精準化和個體化治療?；诖笠?guī)模并行測序技術的高通量測序（next generation sequencing，NGS）具備采用低樣本量同時檢測多個基因多種基因狀態(tài)的能力。隨著檢測速度的加快、測序成本的降低，目前NGS在臨床腫瘤患者基因狀態(tài)的檢測中已逐步取代低通量的Sanger測序和中通量的焦磷酸測序。NGS可同時檢測多個樣本DNA和RNA水平的多種形式的基因突變，包括小片段的插入缺失、點突變、拷貝數(shù)突變、基因重排等，可用于指導腫瘤患者治療藥物選擇和預后預測，并有助于腫瘤發(fā)病機制的研究。本研究采用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel V2（ life technologies）檢測了367例多種類型實體腫瘤中與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療相關的50個基因的近2 800個基因位點的狀態(tài)，為臨床的個體化診療提供了依據(jù)，并為我國腫瘤患者的發(fā)病機理研究累積數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標本來源

367例多種類型實體腫瘤樣本均為福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed，paraffinembedded，F(xiàn)FPE）組織樣本與外周血配對樣本。所有腫瘤組織樣本腫瘤細胞含量≥20%或經(jīng)人工富集后腫瘤細胞含量≥20%。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量 所有腫瘤組織均進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）染色，由有資質的病理醫(yī)生進行腫瘤細胞含量評估。5～10 μm FFPE切片經(jīng)脫蠟后，若腫瘤細胞含量≥20%，直接采用手術刀片刮取并收集腫瘤細胞于1.5 mL離心管中；若需人工富集樣本，比對HE劃圈區(qū)刮取白片圈內(nèi)組織收集腫瘤細胞于1.5 mL離心管中；無法進行人工富集或人工富集后腫瘤細胞含量依舊<20%的樣本未進行下一步檢測。采用TIANamp FFPE DNA Kit [天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP331]試劑盒提取FFPE組織基因組DNA。采用TIANamp Genomic DNA Kit [天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP304]試劑盒提取外周血基因組DNA。所有基因組DNA均采用Qubit dsDNA HS試劑盒（美國ThermoFisher Scientific公司）測定DNA濃度，采用Nanodrop 2000分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）測定純度，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 文庫構建及測序 采用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel V2（美國ThermoFisher Scientific公司）和Ion AmpliSeq library Kit 2.0（美國ThermoFisher Scientific公司）構建文庫，所有操作步驟嚴格按說明書進行。每一樣本FFPE組織DNA和外周血DNA均按15 ng總量投入同一批次平行建庫。文庫采用Agilent 2100生物分析儀（美國Agilent公司）進行文庫片段大小判定，合格文庫片段范圍為111～187 bp（平均為154 bp）；采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）測定文庫濃度，要求文庫濃度>100 pmol/L；文庫片段大小或濃度不滿足要求的樣本，需重新進行文庫構建。合格文庫根據(jù)文庫定量結果稀釋進行多樣本文庫混合，經(jīng)乳液PCR[Ion One Touch 2系統(tǒng)（美國ThermoFisher Scientific公司）和測序模板富集[Ion One Touch ES系統(tǒng)（美國Thermo fisher Scientific公司）]，采用BES 4000基因測序儀（北京博奧生物集團）進行測序分析，平均測序深度>2 000×。

1.2.3 生物信息學分析 測序所得的原始數(shù)據(jù)，采用Torrent Suite V5.2軟件（美國ThermoFisher Scientific公司），以人類基因組hg19為參考序列進行序列比對和堿基識別。采用Torrent Variant Caller V5.2軟件（美國ThermoFisher Scientific公司）篩選基因突變位點，并通過綜合基因組學查看器（intergrative genomics viewer，IGV；美國Broad研究所）進行確認。確定基因突變位點后，通過比對同一樣本FFPE組織和外周血突變位點，去除胚系突變和克隆性造血突變位點。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用Pearsonχ2、Fisher's精準檢驗或連續(xù)校正法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樣本特征

367例樣本中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）294例（肺腺癌270例、鱗癌19例、其他5例）、胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST） 32例、結直腸癌28例、胃癌6例、卵巢癌4例、肝癌3例。男性患者190例，女性患者177例，年齡為58（30～86）歲；≥58歲191例，<58歲176例。見表1、表2。

表1 實體腫瘤樣本的特征及基因突變情況 例

表2 NSCLC樣本特征及基因突變情況 例

2.2 基因突變分析

在367例腫瘤樣本中，235例（64.03%）至少存在1種基因的突變。在存在基因突變的235例樣本中，有167例（71.07%）為1種基因突變，有57例（24.26%）為2種基因突變，有10例（4.26%）為3種基因突變，有1例（0.43%）為4種基因突變。在367例腫瘤樣本中共檢出28種基因的突變，突變例數(shù)≥10例的基因有9種，以EGFR基因突變率最高（32.15%，118/367），其次依次為TP53（15.53%，57/367）、K-ras（8.17%，30/367）、c-kit（5.72%，21/367）、腺瘤性結腸息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）（3.00%，11/367）、同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）（3.00%，11/367）、B-raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶（BRAF-B-Raf proto-oncogene，serine/threonine kinase，B-raf）（2.72%，10/367）、ERBB2（2.72%，10/367）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸催化激酶3 α亞基（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIKC3CA）（2.72%，10/367），見圖1。TP53突變在被檢的多數(shù)瘤種中均存在，K-ras突變主要發(fā)生在結直腸癌中，而c-kit基因突變主要發(fā)生在GIST中。

2.3 基因突變在各類型腫瘤中的分布

圖1 實體腫瘤基因突變例數(shù)

在不同腫瘤中，發(fā)生突變的基因和突變率存在較大差異，見圖2。在294例NSCLC樣本中共檢測到23種基因的突變，有62.24%（183/294）的樣本至少檢出了1個基因的突變。在294例NSCLC樣本中基因突變例數(shù)≥5例的基因有8種，其中EGFR的突變率最高（40.14%），其次依次為TP53（13.61%）、K-ras（6.12%）、ERBB2（3.40%）、B-raf（3.06%）、PTEN（2.72%）、APC（2.38%）、PIK3CA（1.70%），見圖2（a）。EGFR的突變主要集中在外顯子19和21，分別占51.69%（61/118）和38.14%（45/118），外顯子18、20及其他外顯子所占比例較少；EGFR突變類型較多，最為常見的為外顯子19的缺失（35.5%，42/118）和L858R（50.00%，59/118）。在檢測樣本中共發(fā)現(xiàn)8種外顯子19的缺失，其中以p.E746_A750del最為常見；5例樣本存在EGFR2個基因位點的共突變，其突變類型分別為L861Q&G719S、L861Q&G719A、L858R&E709V、L858R&R108K、N771_P772insN&S720F，未檢測到T790M與其他基因的共突變。TP53基因以點突變?yōu)橹?，主要集中在外顯子5～8上，但未發(fā)現(xiàn)某一密碼子偏好性；K-ras基因的突變則全部發(fā)生于密碼子12（94.44%，17/18）或13（5.56%，1/18）上，突變類型分別為p.G12C（33.33%，6/18）、p.G12D（27.78%，5/18）、p.G12V（22.22%，4/18）、p.G12A（11.11%，2/18）和p.G13C（5.56%，1/18）；ERBB2的主要突變類型為p.A775_G776insYVMA（60.00%，6/10），其余基因的突變因檢測到突變例數(shù)較少，無明顯規(guī)律性。

在GIST中，基因突變率為68.75%（22/32），以c-kit基因的突變?yōu)橹?，突變率?3.13%（17/32）。c-kit基因突變主要集中于外顯子11上（64.71%，11/17），以外顯子11的點突變和插入缺失為主，其次為PDGFRA的突變（9.38%，3/32），見圖2（b）。28例結直腸癌中，23例（82.14%）檢出了至少1種基因的突變：K-ras的突變率最高為42.86%（12/28），主要集中于密碼子12上，見圖2（c）；TP53的突變次之為34.38%（11/32），同NSCLC，在結直腸癌中TP53基因以點突變?yōu)橹?，但無某一位點偏好性；PIK3CA的突變主要以p.H1047R和p.E545X為主，而3例APC基因的突變均為exon14的移碼突變。在胃癌中檢測到2例TP53的點突變。4例卵巢癌樣本均檢測到基因突變：2例為TP53基因的點突變，1例為c-kit基因exon10上的點突變，1例為PTEN與TP53共突變。3例肝癌樣本中檢測到1例PTEN突變。

圖2 實體腫瘤基因突變圖譜

2.4 多基因的共突變

在檢測到基因突變的235例樣本中，28.97%（68/235）的樣本存在2種或2種以上基因的共突變，TP53與其他基因的共突變率最高為57.35%（39/68）。在57例2個基因共突變樣本中，有34例（59.65%）為TP53基因與其他基因的共突變，其中79.41%（27/34）為與EGFR-RAS-RAF信號通路的共突變，8.82%（3/34）為與PTEN的共突變；有9例（15.79%）為EGFR基因與APC、KDR、K-ras等基因的共突變；有3例（5.26%）為PTEN分別與ERBB2、SMAD4、CTNNB1的共突變；有3例（5.26%）為K-ras分別與B-raf、PIK3CA、APC的共突變；有2例為c-kit分別與PDGFRA、ABL1的共突變；其余6例為隨意2個基因的組合，無規(guī)律性。檢測到10例3個基因的共突變，其中5例為TP53與其他2個基因共突變，4例為APC與其他基因的共突變，1例為c-kit、PTEN、SMAD4的共突變。還有1例為APC、MLH1、PIK3CA和FBXW7 4個基因的共突變。

2.5 基因突變與患者性別、年齡的關系

分析基因突變與患者性別、年齡之間的關系。結果顯示，是否發(fā)生基因突變與患者的性別及年齡無關，但≥58歲的患者的TP53突變率明顯高于<58歲的患者（P<0.001）。見表1。

因EGFR、ERBB2基因突變僅發(fā)生于NSCLC中，故僅統(tǒng)計了這2個基因與NSCLC患者性別、年齡及病理分型之間的關系。結果顯示，發(fā)現(xiàn)EGFR在女性（P<0.01）、肺腺癌（P<0.001）患者中突變率較高；ERBB2在<58歲患者中突變率較高（P=0.001）。見表2。

3 討論

從內(nèi)在因素分析，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一系列基因突變共同作用的結果，了解腫瘤的分子圖譜能指導腫瘤的精準治療并預測預后。針對腫瘤分子圖譜的大規(guī)模研究如腫瘤基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）、國際癌癥基因組聯(lián)合體（the International Cancer Genome Consortium，ICGC）已明確了多種實體腫瘤的主要驅動基因[4]，但這些研究大多為采用NGS平臺的全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）。雖WES在技術上可行，但因其產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)分析問題及較高的費用問題，依舊是其應用于臨床的障礙。針對單個腫瘤患者的檢測，基于各種基因組合的高通量靶向測序因其費用低、靈活等優(yōu)點，目前在臨床上應用較為廣泛。

在實際應用中，如何精準檢出腫瘤特有的體細胞突變對腫瘤患者的治療及預后至關重要。針對無正常對照配對的腫瘤樣本，雖然目前通過一些算法和過濾標準可以區(qū)分體細胞突變和胚系突變，但如何從體細胞突變中區(qū)分胚系嵌合突變，尤其是針對一些基因如TP53和Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1D（protein phosphatase，Mg2+/Mn2+dependent 1D，PPM1D）的突變尚存在較大的困難[5]。另外，造血干細胞會隨年齡增長累積克隆性突變。有研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血突變具有基因偏向性，絕大多數(shù)DNA甲基轉移酶3α（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A）突變和少數(shù)TP53突變?yōu)榭寺⌒栽煅蛔?，但除采用正常對照樣本目前尚無好的方法區(qū)分克隆性造血突變和體細胞突變[6]。外周血因其易得、創(chuàng)傷小等成為較好的對照材料，故在本研究中采用腫瘤患者的外周血樣本作為配對樣本進行檢測，用于去除患者本身胚系突變和克隆性造血突變。

在50%～60%的人類腫瘤中均存在TP53基因的突變，在大多數(shù)腫瘤中TP53是主要的腫瘤驅動基因。二代測序結果顯示，TP53的突變率在絕大多數(shù)腫瘤中位于所有基因的前3位。在所有腫瘤中，TP53體細胞突變的總突變率為29%，主要集中于外顯子5～8上，以點突變?yōu)橹?，突變位點主要集中于密碼子175、220、245、248、273和282上[7]。本研究結果顯示，TP53的突變率為15.53%，分布于多種腫瘤中，主要集中于外顯子5～8上，以點突變?yōu)橹鞯珶o密碼子偏向性；TP53突變多發(fā)于年齡較大的患者（≥58歲），提示TP53基因突變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

在NSCLC中，EGFR基因突變是最常見的基因突變，本研究中檢測到EGFR基因在NSCLC中的突變率為40.14%，并且在肺腺癌、女性患者中突變率較高，與針對我國NSCLC患者的Meta分析[8]結果一致。本研究檢測到EGFR的突變多發(fā)生于外顯子19和21上，突變類型以exon19缺失和L858R為主，與其他研究報道[9]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中ERBB2基因突變在<58歲的患者中較為常見。而MAZIèRES等[10]的研究結果顯示，ERBB2在女性和未吸煙患者中突變率較高，這可能與種族特異性相關。

在實體瘤中，K-ras的突變主要集中于密碼子12、13上，其他位點的突變較為少見。本研究在結直腸癌患者中檢測到3例密碼子p.A146T的突變，而NSCLC中K-ras基因的突變?nèi)考性诿艽a子12和13上，提示K-ras基因的突變類型可能與腫瘤類型及腫瘤生物學行為相關。作為研究頻次較高的原癌基因，K-ras的基因狀態(tài)不僅能指導酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）類、單抗類等靶向藥物的治療，還可作為免疫節(jié)點抑制劑類基因標志物，攜帶K-ras突變的NSCLC患者可從免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）類藥物獲益[11]。

多基因或多位點的共突變提示腫瘤的生物性質可能會因多基因或多位點的共突變而發(fā)生改變，進而影響腫瘤的行為和臨床結果。VANDERLAAN等[12]發(fā)現(xiàn)，在EGFR陽性的NSCLC中較常見到TP53基因的共突變并且基因的共突變會影響臨床結果。LABBé等[13]的研究結果顯示，存在EGFR、TP53共突變的NSCLC患者對TKI類藥物獲益較少，無進展生存期也較短。本研究結果也顯示，在所有存在共突變的樣本中，TP53基因與其他基因的共突變率最高。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)部分排他性突變的共突變，如EGFR與K-ras、K-ras與B-raf、K-ras與PIK3CA等。目前，腫瘤治療的主要策略是確定瘤種相關的腫瘤驅動基因，根據(jù)其基因突變或蛋白產(chǎn)物狀態(tài)進行靶向治療。但基因共突變，尤其是排他性共突變的存在，提示在腫瘤治療中，尤其是在靶向藥物治療中應考慮多基因、多位點共突變對藥物療效的影響。

與傳統(tǒng)檢測方法如Sanger測序、突變阻滯擴增系統(tǒng)-聚合酶聯(lián)反應（amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction，ARMS-PCR）等相比，NGS檢測的基因突變范圍和突變類型更為全面，能為臨床提供更全面的信息，使腫瘤治療更加精準化。本研究采用NGS檢測了多種實體腫瘤中基因突變情況，繪制了不同腫瘤的基因突變圖譜，檢測出了高頻率的基因共突變，但未分析與臨床結果之間的關系，今后將對此作進一步研究。