4種SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑一致性評(píng)價(jià)

顏新生，楊薈薈，蒿葉霞，胡元萍，張李濤，廖 鑫，范慶坤，劉澤金

（1.武漢亞心總醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430056；2.武漢亞洲心臟病醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430022）

目前，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的檢測(cè)仍是新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的主要確診依據(jù)[1]。診斷COVID-19的2種分子生物學(xué)方法中，一種是病毒的基因測(cè)序，一種是實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）核酸檢測(cè)?；驕y(cè)序需要較昂貴的設(shè)備以及生物信息團(tuán)隊(duì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析解讀，檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，難以普及[2]。因此，臨床上主要依靠實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè)方法。截至2020年2月26日，我國(guó)相關(guān)部門依據(jù)《醫(yī)療器械應(yīng)急審批程序》先后批準(zhǔn)了6家企業(yè)的6種實(shí)時(shí)熒光RTPCR法SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒，全力服務(wù)疫情防控需要，為COVID-19的診斷提供了重要保障。同時(shí)不斷有企業(yè)研發(fā)、生產(chǎn)相關(guān)核酸檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品供應(yīng)已經(jīng)得到了極大的緩解。然而，在臨床實(shí)際應(yīng)用過程中，核酸檢測(cè)結(jié)果受到采樣部位、采樣時(shí)機(jī)、標(biāo)本的運(yùn)輸、保存條件、實(shí)驗(yàn)室的操作流程和檢測(cè)試劑的敏感性、特異性等多種因素的影響。通過加強(qiáng)人員的培訓(xùn)可以很大程度解決標(biāo)本的問題，與此同時(shí)，高質(zhì)量的核酸檢測(cè)試劑就顯得尤為重要[3]。正常情況下，從研發(fā)到取得核酸檢測(cè)類試劑盒注冊(cè)證需要3～5年，其間需要不斷優(yōu)化，并通過大量臨床標(biāo)本的驗(yàn)證。由于疫情初期核酸檢測(cè)試劑盒研發(fā)時(shí)間緊迫，臨床試驗(yàn)規(guī)模太小，缺乏大量科學(xué)數(shù)據(jù)支撐，核酸檢測(cè)試劑盒特別是初代批次試劑盒的檢測(cè)性能不盡如人意，給臨床診斷造成了較大的困擾。本研究在現(xiàn)有的條件下，比較4家已批準(zhǔn)上市的SARSCOV-2核酸檢測(cè)RT-PCR試劑盒的檢測(cè)性能，供各臨床實(shí)驗(yàn)室參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2020年2月18—24武漢亞心總醫(yī)院住院的COVID-19患者鼻咽拭子標(biāo)本204例，患者男104例、女100例，年齡12～92歲。本研究經(jīng)武漢亞心總醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審核通過（倫理號(hào)：WAGHMEC-KY-2020004），并批準(zhǔn)予以豁免患者知情同意。

1.2 儀器與試劑

病毒采樣管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司），磁珠法病毒核酸提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司），Kingfisher Duo Prime核酸提取儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），Cobas z480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），SLAN-96S實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。選取4家不同企業(yè)生產(chǎn)的已取得緊急審批注冊(cè)證的核酸檢測(cè)試劑盒，4種試劑基本情況見表1。

表1 4種SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑基本情況

1.3 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)

采用磁珠法病毒核酸提取試劑盒對(duì)鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行RNA病毒的提取。采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，按照試劑說明書建議，對(duì)SARSCov-2進(jìn)行基因檢測(cè)。其中A、B、C試劑針對(duì)ORF1ab基因和N基因進(jìn)行雙靶標(biāo)檢測(cè)，D試劑針對(duì)SARS-Cov-2高度保守區(qū)域ORF1ab基因進(jìn)行單靶標(biāo)檢測(cè)。4種試劑均設(shè)置了內(nèi)參對(duì)照，用于對(duì)標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸以及核酸提取過程進(jìn)行監(jiān)控，減少假陰性結(jié)果。核酸檢測(cè)結(jié)果判定參考試劑說明書建議的Ct值，并根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》建議[4]，對(duì)于ORF1ab基因和N基因同時(shí)陽(yáng)性的結(jié)果，報(bào)告為陽(yáng)性，若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，判定為可疑，需復(fù)查或重新采樣復(fù)查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MedCalc16.2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2×2四格表總結(jié)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)各試劑盒的一致性進(jìn)行kappa一致性分析，不同試劑間的一致性比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)SARS-CoV-2的整體檢出率比較

在4種試劑整體檢出率（任一基因檢出即視為檢出）和ORF1ab基因檢出率的比較中，采用在臨床診斷為COVID-19的基礎(chǔ)上，4種試劑任一試劑檢出陽(yáng)性為參考。在N基因檢出率比較中，采用在臨床診斷為COVID-19的基礎(chǔ)上，A、B、C 3種試劑任一試劑檢出陽(yáng)性為參考。任一試劑檢出陽(yáng)性標(biāo)本123例，全陰性標(biāo)本81例。在整體檢出率比較中，A、B、C、D 4種試劑陽(yáng)性檢出率分別為72.4%、78.0%、59.3%和72.4%，不同試劑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011），見表2。

表2 4種試劑對(duì)SARS-CoV-2的整體檢出率比較

2.2 4種核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)SARS-CoV-2的ORF1ab基因和/或N基因檢出率比較

204例標(biāo)本中，針對(duì)ORF1ab基因共檢出107例陽(yáng)性、97例陰性，A、B、C、D試劑對(duì)SARSCoV-2ORF1ab基因的檢出率分別為47.7%、31.8%、68.2%和83.2%，不同試劑檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000 1），見表3。針對(duì)N基因共檢出105例陽(yáng)性、99例陰性，A、B、C試劑對(duì)SARS-CoV-2N基因的檢出率分別為79.0%、90.5%和16.2%，不同試劑檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000 1），見表4。此外，在4種試劑對(duì)ORF1ab基因檢出不一致的83例標(biāo)本中，Ct值>34（弱陽(yáng)性）的標(biāo)本70例（84.3%）。在83例檢出不一致的樣本中，試劑A、B、C、D分別檢出26例（31.3%）、10例（12.0%）、49例（59.0%）和64例（77.1%）。

表3 4種試劑對(duì)SARS-CoV-2的ORF1ab基因的檢出率

表4 A、B、C 3種試劑對(duì)SARS-Cov-2的N基因的檢出率

3 討論

SARS-CoV-2是一種新型β屬冠狀病毒，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類呼吸道感染[5]，該冠狀病毒為第7種可感染人類的冠狀病毒家族成員[6]。對(duì)SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)是COVID-19的確診依據(jù)和痊愈出院指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，4種檢測(cè)試劑盒對(duì)SARSCoV-2，特別是對(duì)弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢出率存在較大差異，可能與試劑引物設(shè)計(jì)和探針設(shè)計(jì)有關(guān)，也可能與模板量或各組分在體系中的配比有關(guān)，從而導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度不高。由于疫情突發(fā)，各企業(yè)緊急投入試劑研發(fā)和生產(chǎn)，初代批次試劑盒難免存在問題，有一定的漏檢率，應(yīng)對(duì)可疑結(jié)果使用另一種試劑盒進(jìn)行復(fù)檢。本研究只針對(duì)現(xiàn)有的試劑批號(hào)進(jìn)行比較，存在一定的局限性，不能完全代表其他批次試劑的檢測(cè)性能。在實(shí)際應(yīng)用過程中，特別是初代批次試劑盒的使用過程中，應(yīng)盡可能對(duì)不同品牌和批號(hào)的試劑盒進(jìn)行比較驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果務(wù)必結(jié)合臨床判斷，以彌補(bǔ)初代試劑盒的缺陷。另外，還需要關(guān)注和驗(yàn)證標(biāo)本采集管、提取試劑和擴(kuò)增儀器與各品牌試劑盒的匹配適用性，以找到最優(yōu)條件，最大程度提高試劑盒的敏感性和特異性。

隨著COVID-19出院患者的增多，其病毒核酸檢測(cè)“復(fù)陽(yáng)”情況受到廣泛關(guān)注，有COVID-19患者治愈出院后，再次出現(xiàn)咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性[7]。本研究團(tuán)隊(duì)小樣本研究結(jié)果顯示，數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)的敏感性要比目前RTPCR高5～10倍，因此出院前的2次核酸檢測(cè)陰性結(jié)果很有可能是由于標(biāo)本中的病毒載量低于試劑盒最低檢測(cè)限導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。有條件的實(shí)驗(yàn)室可采用更敏感的數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)來降低假陰性情況的發(fā)生，同時(shí)應(yīng)關(guān)注檢驗(yàn)前、中、后各環(huán)節(jié)其他影響因素，注意采樣部位和方式、運(yùn)輸和保存條件以及提取擴(kuò)增環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。并把抗體的檢測(cè)作為核酸檢測(cè)的有效補(bǔ)充，提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的特異性和檢出率[8]，從而降低漏診和誤診帶來的風(fēng)險(xiǎn)。