致傷口感染犬巴斯德菌耐藥基因全基因測序分析

薛玉芹，黃 韻，張正銀，王亞婷，金 英，桂 蕓，余 彬

（上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200126 ）

犬巴斯德菌屬于巴斯德菌屬，廣泛分布于健康或患病的動(dòng)物中，常寄生于動(dòng)物的鼻咽部和牙齦[1]。人類感染犬巴斯德菌主要與動(dòng)物咬傷、撓傷等密切接觸行為以及一些非創(chuàng)傷性的日常接觸，如舔舐等有關(guān)。臨床最常見的感染是狗咬傷所致傷口皮膚及軟組織感染。犬巴斯德菌感染人類較為少見，但近些年隨著寵物流行等原因，人類犬巴斯德菌感染病例呈上升趨勢[2]。本研究分析1例因狗咬傷導(dǎo)致雙足及右前臂皮膚撕裂傷感染患者的臨床資料，并通過全基因測序的方法分析其攜帶的耐藥基因，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例資料

患者女，30歲，因“狗咬傷致雙足及右前臂疼痛伴皮膚撕裂傷2 d”于2018年8月3日門診就診。入院時(shí)可見多處皮膚裂傷，伴有局部腫脹，急診予以犬傷處理原則處理傷口，并注射狂犬疫苗。3 d后雙足腫痛，右前臂疼痛且活動(dòng)受限，為進(jìn)一步治療收入院。入院查體：體溫36.7 ℃，脈搏67次/min，呼吸20次/min，血壓13.83/8.65 kPa（104/65 mmHg）。?？茩z查：雙足可見多處皮膚裂傷，局部皮膚紅腫，壓痛（+），關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍正常，皮膚感覺正常，雙下肢肌力Ⅴ級，足背動(dòng)脈可及；輔助檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)8.0×109/L，中性粒細(xì)胞百分比70%，C反應(yīng)蛋白42 mg/L，紅細(xì)胞沉降率40 mm/h。8月7日右足腫脹明顯，有膿液滲出，擠壓后膿液量增多，采集膿液樣本送細(xì)菌培養(yǎng)，當(dāng)日行清創(chuàng)負(fù)壓封閉引流術(shù)，經(jīng)驗(yàn)給予頭孢呋辛鈉抗感染治療。8月12日拆除引流管，拆除后見左足傷口新鮮肉芽組織生長，右足原傷口處仍有較多滲出，考慮感染控制不佳。

1.2 方法

按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）的操作方法，將右足傷口膿液分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板（上?？岂R嘉公司），35 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)出的可疑菌株采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析鑒定系統(tǒng)及配套鑒定卡（法國生物梅里埃公司）進(jìn)行菌株鑒定。采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。藥物敏感性試驗(yàn)紙片[氨芐西林（10 μg/片）、阿莫西林-克拉維酸（20/10 μg/片）、頭孢曲松（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、四環(huán)素（10 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、復(fù)方磺胺甲噁唑（25 μg/片）]購自英國OXOID公司，培養(yǎng)基為M-H瓊脂平板（上海科馬嘉公司），35 ℃培養(yǎng)18 h。抑菌圈直徑判讀依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M45文件[6]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。分離菌株送上海伯杰生物科技有限公司進(jìn)行全基因測序。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

患者右足傷口膿液于35 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，血平板和巧克力平板可見濕潤光滑、灰白色不溶血菌落生長（圖1），麥康凱平板未見細(xì)菌生長。細(xì)菌經(jīng)革蘭染色為陰性，氧化酶、觸酶均為陽性，鏡下可見革蘭陰性球桿菌（圖1）。VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析鑒定系統(tǒng)鑒定為犬巴斯德菌，可信度99%。再次取傷口膿液送細(xì)菌培養(yǎng)，鑒定結(jié)果仍為犬巴斯德菌。

圖1 犬巴斯德菌血平板及鏡下菌落形態(tài)

2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

抑菌圈直徑分別為：氨芐西林27 mm、青霉素33 mm、阿莫西林克拉維酸30 mm、頭孢曲松34 mm、左氧氟沙星30 mm、四環(huán)素30 mm、阿奇霉素28 mm、紅霉素19 mm、復(fù)方磺胺甲噁唑28 mm。體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本臨床分離株對青霉素、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林、頭孢曲松、左氧氟沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑均敏感，對紅霉素耐藥。結(jié)合藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)查閱，建議臨床改用青霉素鈉，同時(shí)對患者進(jìn)行清創(chuàng)術(shù)和加強(qiáng)傷口護(hù)理，患者于8月31日痊愈出院。

2.3 全基因測序結(jié)果

鑒于本犬巴斯德分離菌株對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物如氨芐西林、青霉素、頭孢曲松等均敏感，但臨床用藥頭孢呋辛鈉效果不佳，懷疑存在該菌耐藥表型和耐藥基因型不一致的情況。對分離菌株進(jìn)行全基因測序，測序結(jié)果顯示：基因組大小為6 136 728 bp，GC含量為36.82%。采用BLAST軟件預(yù)測在基因組中存在的與抗菌藥物抗性相關(guān)的基因，采用E-value進(jìn)行BLAST比對，臨界值設(shè)置為1×106，氨基酸序列的一致性>45%，且序列比對的長度與其序列長度的比值≥70%（表1）。結(jié)果顯示，該菌株基因組含有18種耐藥基因（tuf2、MacB、mdtK、tet35、hns、parE、parC、gyrA、rpoB、rpoC、crp、basR、fol、gyrB、strA、dfrA3、cpxR、tet34）、19種抗菌藥物靶基因和2種抗菌藥物合成基因，未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物相關(guān)耐藥基因，但發(fā)現(xiàn)其基因組中攜帶喹諾酮類耐藥決定區(qū)域（DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶）編碼基因parC、parE、gyrA和gyrB，測序結(jié)果未見該耐藥決定區(qū)域相關(guān)耐藥基因的突變。

3 討論

人類被狗或貓咬傷后的傷口感染包含多種需氧及厭氧的混合菌群（與咬傷動(dòng)物的口腔菌群吻合）[3]。TALAN等[4]發(fā)現(xiàn)，狗咬傷中最常見的需氧菌和厭氧菌分別是巴斯德菌屬（50%）、鏈球菌屬（46%）、葡萄球菌屬（46%）、梭桿菌屬（32%）及擬桿菌屬（30%）。有研究結(jié)果顯示，犬巴斯德菌是狗咬傷傷口感染中最常（26%）被分離到的細(xì)菌[3]。因犬巴斯德菌在麥康凱平板上不生長，易被忽視。

臨床對于狗或貓咬傷患者經(jīng)驗(yàn)性用藥應(yīng)包括抗巴斯德菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬和梭桿菌屬感染的抗菌藥物，推薦使用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、二代頭孢菌素，聯(lián)合使用青霉素和第一代頭孢類藥物或克林霉素和氟喹諾酮類抗菌藥物[5]。巴斯德菌屬通常對大多數(shù)抗菌藥物敏感，其中氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是針對巴斯德菌屬感染最有效的藥物[6-7]。本研究分離到的犬巴斯德菌對氨芐西林、青霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松、左氧氟沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑均敏感，僅對紅霉素耐藥，但臨床經(jīng)驗(yàn)使用頭孢呋辛鈉控制感染效果不佳。有研究發(fā)現(xiàn)青霉素對巴斯德菌屬、梭桿菌屬及梭菌屬等非常有效[8]。結(jié)合體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，我們與臨床溝通，建議改用青霉素鈉進(jìn)行治療，抗感染治療有效。

本研究全基因測序未發(fā)現(xiàn)該基因組中含有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物相關(guān)耐藥基因，但發(fā)現(xiàn)其基因組中攜帶喹諾酮類耐藥決定區(qū)域（DNA和拓?fù)洚悩?gòu)酶）編碼基因gyrA、gyrB、parC和parE。喹諾酮類藥物作用靶點(diǎn)主要是能結(jié)合于細(xì)菌DNA復(fù)制過程中的2種關(guān)鍵酶——DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，其中DNA促旋酶A亞單位是喹諾酮類藥物對革蘭陰性菌的主要靶點(diǎn)，而拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是革蘭陽性菌的主要靶點(diǎn)，這些細(xì)菌酶靶點(diǎn)的抑制會干擾細(xì)菌分裂和基因表達(dá)而達(dá)到殺菌的作用。 目前革蘭陰性菌喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制分為2類：一類為細(xì)菌的DNA促旋酶A亞單位（GyrA、GyrB）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ C亞單位（ParC、ParE）編碼基因突變，最易發(fā)生耐藥相關(guān)突變的是gyrA基因第83號絲氨酸、87號天門冬氨酸以及parC基因第79號色氨酸和83號天門冬氨酸[9]，該區(qū)域被稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）；另一類為由質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥相關(guān)基因qnrA、B、C、D、S5個(gè)qnr基因的變異體、aac（6'）-Ib-Cr[10]以及qepA基因[11]，本研究分離菌株全基因測序未發(fā)現(xiàn)aac（6'）-Ib-Cr、qnr、qepA及其同源序列的存在。本研究分離株基因組中雖攜帶了喹諾酮類藥物耐藥基因parC、parE、gyrA和gyrB，但測序結(jié)果未見該耐藥決定區(qū)域相關(guān)耐藥基因的突變，但細(xì)菌的耐藥與其對抗菌藥物選擇壓力基因突變有關(guān)，鑒于目前已有文獻(xiàn)[12]報(bào)道犬巴斯德菌對青霉素耐藥及對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物過敏患者，所以喹諾酮類藥物可能會成為治療犬巴斯德菌感染患者的首選藥物，其耐藥性可能會迅速發(fā)展。

隨著寵物的流行，人類犬巴斯德菌相關(guān)感染可能會日趨普遍。鑒于犬巴斯德菌基因組攜帶有喹諾酮類藥物相關(guān)耐藥基因，喹諾酮類藥物作為治療犬巴斯德菌感染的最有效藥物之一，隨著藥物的長期使用，其耐藥性可能會快速發(fā)展，應(yīng)引起臨床重視。