內(nèi)源性尿素對(duì)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)TgAb、TPOAb和TSH的干擾研究

李立和，孫國(guó)忠，張 超

（天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院檢驗(yàn)科，天津 301800）

化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)[1]，主要用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)，但檢測(cè)過程中常受到內(nèi)源性物質(zhì)（類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶）、外源性因素（細(xì)菌污染、溶血、儲(chǔ)存時(shí)間）和其他物質(zhì)（尿素、治療性抗體、生物素）的干擾[2]。本研究擬探討內(nèi)源性尿素對(duì)CLIA檢測(cè)結(jié)果的干擾。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院透析室的腎功能衰竭患者30例，其中男18例、女12例，年齡32～62歲。另選取天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院體檢健康者45名，其中男23例、女22例，年齡25～65歲。

1.2 試劑與儀器

尿素（相對(duì)分子質(zhì)量60.06，分析純，批號(hào)180620）購(gòu)自上海展云化工有限公司，尿素酶（20 KU，批號(hào)L2659Y70919）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。TG328A型分析天平購(gòu)自上海市分析天平二廠。采用ADVIA Centaur XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國(guó)西門子公司）及配套試劑（CLIA）檢測(cè)甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TgAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）和促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH），試劑批號(hào)分別為38636326、70608276、59465335。采用AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）及配套試劑（速率法，試劑批號(hào)為20190311）檢測(cè)血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.3 方法

分別采集30例腎功能衰竭患者透析前、后的靜脈血3.0 mL，離心分離血清，用于檢測(cè)TgAb、TPOAb和TSH濃度。取體檢健康者的混合血清，檢測(cè)TgAb、TPOAb、TSH和BUN濃度，隨后加入不同濃度（20、10、30、40、50、60 mmol/L）尿素，再次檢測(cè)TgAb、TPOAb、TSH和BUN濃度。根據(jù)文獻(xiàn)[3]中的酶動(dòng)力學(xué)方程及尿素轉(zhuǎn)化率、作用時(shí)間、米氏常數(shù)、尿素濃度等計(jì)算出加入腎功能衰竭患者血清中的尿素酶濃度為800 U/L，加入尿素酶后分別檢測(cè)患者透析前、后血清TgAb、TSH和TPOAb濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb和TSH濃度的比較

腎功能衰竭患者透析后血清TgAb、TPOAb和TSH濃度高于透析前（P<0.001）。見表1。

表1 腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb和TSH濃度的比較

2.2 TPOAb<15.0 IU/mL、TgAb<15.0 IU/mL的患者透析前、后TPOAb、TgAb項(xiàng)目發(fā)光值的比較

TPOAb<15.0 IU/mL、TgAb<15.0 IU/mL的患者透析前、后TPOAb、TgAb項(xiàng)目的發(fā)光值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 TPOAb＜15.0 IU/mL、TgAb＜15.0 IU/mL的患者透析前、后TPOAb、TgAb項(xiàng)目發(fā)光值的比較 ×105 RLU

2.3 體檢健康者混合血清加入不同濃度尿素前后TgAb、TPOAb、TSH、BUN濃度的變化

在體檢健康者混合血清中加入不同濃度的尿素。與加入尿素前比較，加入尿素后TgAb、TPOAb、TSH濃度隨尿素濃度的升高而逐漸降低，BUN濃度逐漸升高。見表3、圖1。

表3 體檢健康者混合血清加入不同濃度尿素前后TgAb、TPOAb、TSH、BUN濃度的變化

圖1 不同濃度尿素對(duì)CLIA測(cè)定TgAb、TSH、TPOAb發(fā)光值的干擾作用

2.4 加入尿素酶后腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH濃度的變化

加入800 U/L尿素酶后，腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 加入尿素酶后腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH濃度的變化 ±s

表3 加入尿素酶后腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH濃度的變化 ±s

TPOAb/（IU/mL）透析前 26 46.20±7.24 3.21±1.68 62.10±6.23透析后 26 45.90±7.31 3.18±1.72 62.45±6.50 t值 -0.496 -0.389 -0.408 P值 0.622 0.256 0.686組別 例數(shù) TgAb/（IU/mL）TSH/（mIU/mL）

3 討論

CLIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，因而在臨床實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛應(yīng)用。有研究結(jié)果顯示，在干擾實(shí)驗(yàn)（6、7、8 mol/L尿素分別反應(yīng)5 min，7 mol/L尿素反應(yīng)10 min）中，尿素對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾可達(dá)19%～31%[4]。健康人的血清尿素濃度為3.1～8.0 mmol/L，而腎功能衰竭患者血清尿素濃度為17.9～70.0 mmol/L[5]，因此腎功能衰竭患者體內(nèi)的內(nèi)源性尿素極易對(duì)CLIA的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。

本研究結(jié)果顯示，雙抗體夾心法檢測(cè)TgAb、TSH、TPOAb的濃度隨尿素濃度的升高而降低；腎功能衰竭患者透析后血清TgAb、TPOAb和TSH濃度高于透析前（P<0.001），且隨著尿素濃度的升高，TgAb、TPOAb、TSH項(xiàng)目的發(fā)光值出現(xiàn)明顯變化。在TPOAb<15.0 IU/mL、TgAb<15.0 IU/mL的透析患者中，由于無TgAb、TPOAb參與抗原-抗體偶聯(lián)發(fā)光物的反應(yīng)，尿素不影響TgAb、TPOAb測(cè)定的發(fā)光值，因此透析前、后TPOAb、TgAb項(xiàng)目發(fā)光值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由于本研究的腎功能衰竭患者無極低值TSH，因此未對(duì)極低值TSH進(jìn)行尿素干擾實(shí)驗(yàn)。另外，考慮到三碘甲狀腺原氨酸與游離三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素與游離甲狀腺素間會(huì)相互轉(zhuǎn)化，因此本研究也未對(duì)這4個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行尿素干擾實(shí)驗(yàn)。有研究結(jié)果顯示，在感染類項(xiàng)目，如乙型肝炎表面抗體的CLIA檢測(cè)中，一般將血清樣本稀釋10～100倍后再進(jìn)行檢測(cè)，因此內(nèi)源性尿素基本不會(huì)產(chǎn)生干擾。本研究結(jié)果顯示，加入尿素酶后，腎功能衰竭患者透析前、后血清TgAb、TPOAb、TSH濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示尿素酶可以消除內(nèi)源性尿素的干擾，進(jìn)一步證實(shí)尿素會(huì)對(duì)CLIA檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點(diǎn)之間的結(jié)合，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，抗原決定簇和抗體分子可變區(qū)互補(bǔ)構(gòu)型，使分子間有較強(qiáng)的親和力?？臻g構(gòu)型互補(bǔ)程度不同，抗原和抗體分子之間結(jié)合力強(qiáng)弱也不同，互補(bǔ)程度高，則親和力強(qiáng)。抗原抗體結(jié)合是一種非共價(jià)鍵結(jié)合，維系這種結(jié)合是靜電引力、范登華力、氫鍵和疏水鍵共同作用的結(jié)果，使抗原抗體結(jié)合穩(wěn)定并存在解離的可逆性。本研究結(jié)果顯示，在血清中加入高濃度尿素后，尿素分子與抗體肽鏈形成氫鍵的能力比水分子強(qiáng)，尿素分子中氫原子與抗體肽鏈中的氧原子作用而形成氫鍵，能破壞抗體蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵，使抗體肽鏈中靠氫鍵維系的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如螺旋、折疊、自由回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)非極性基因與水的疏水作用，導(dǎo)致抗原抗體間的氫鍵、疏水作用大大降低，使低親和力抗體與抗原結(jié)合的互補(bǔ)程度差而發(fā)生解離，從而被洗滌液洗脫；高親和力抗體因與抗原結(jié)合互補(bǔ)程度高，尿素對(duì)其的影響小，所以未被洗脫液洗脫[4，6-7]。由此可見，尿素通過干擾抗原-抗體的結(jié)合強(qiáng)度和結(jié)合率而影響發(fā)光物的偶聯(lián)數(shù)量，使發(fā)光值及檢測(cè)結(jié)果發(fā)生改變。

尿素酶常作為測(cè)定血清尿素氮的工具酶，血清中的尿素在尿素酶的作用下，水解生成氨和二氧化碳。在CLIA反應(yīng)過程中，當(dāng)血清被加入到含有尿素酶的稀釋液中時(shí)，血清中的尿素在尿素酶的作用下，水解生成氨和二氧化碳，使血清中的尿素?zé)o法干擾抗原-抗體的結(jié)合，從而保持反應(yīng)的穩(wěn)定[8]。

綜上所述，較高濃度的內(nèi)源性尿素會(huì)干擾CLIA檢測(cè)TgAb、TPOAb、TSH。因此，對(duì)于透析患者，可在其血清中加入尿素酶后再進(jìn)行檢測(cè)，這樣可以避免由于血清中尿素濃度的變化而使TgAb、TPOAb、TSH檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大的改變。