雅浦海溝海參(Synallactidae)腸道微生物多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

高志遠(yuǎn)楊繼超劉文鳳何培青陳 顥*

(1.自然資源部 第一海洋研究所,山東 青島266061；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266061；3.國家深?；毓芾碇行?山東 青島266061)

雅浦海溝位于雅浦海脊和雅浦群島東側(cè),南北長650 km,最深可達(dá)8 527 m,是典型的超深淵環(huán)境。雅浦海溝具有低溫、高壓、低光/暗、高鹽、低溶解氧和寡營養(yǎng)等特征[1-4],這些特征制約著碳、氮、硫等生源要素分布和生物群落組成,形成超深淵環(huán)境獨(dú)特的物質(zhì)循環(huán)和能量流動體系[5]。微生物在沉積環(huán)境物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞中具有重要作用,目前已有相關(guān)研究揭示了雅浦海溝沉積物中的微生物組成。Zhang等[6]通過宏基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn),雅浦海溝表層沉積物中奇古菌門(48.4%)和γ-變形菌綱(16.9%)占絕對優(yōu)勢；Fu等[7]利用Miseq高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn),在雅浦海溝超深淵深層沉積物中,微生物群落以變形菌門和奇古菌門為主,其中細(xì)菌豐度大于古菌豐度；何高陽等[8]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究了雅浦海溝沉積物中真菌多樣性及其反硝化能力,發(fā)現(xiàn)子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)中的硝酸鹽還原類群占優(yōu)勢。這些微生物類群,通過對不同生物要素轉(zhuǎn)化,對超深淵環(huán)境乃至全球生物地球化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生重要影響。近幾年,“蛟龍?zhí)枴陛d人潛水器在雅浦海溝科學(xué)考察中,還觀察到海參、海綿、海星和海蛇尾等底棲生物[9],但在極端高壓環(huán)境中的采樣技術(shù)限制了這些底棲生物的采集以及進(jìn)一步研究。

海參屬于棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea),營底棲生活,具有簡單的管狀消化道,可容納大量沉積物。海參通過攝取沉積物中的有機(jī)物,如細(xì)菌、硅藻、大型藻類碎屑和原生動物等[10-11]獲得能量。在寡營養(yǎng)海域,表層沉積物缺乏容易被利用的硅藻和大型藻類碎屑,微生物生物量相對較高,可能是海參的直接營養(yǎng)來源,或間接為宿主提供其他途徑無法獲得的必需營養(yǎng)元素[12-15]。利用脂肪酸生物標(biāo)志物追蹤證明,細(xì)菌是日本刺參(Apostichopusjaponicus)最主要的食物來源,占其能量需求量的70%以上[16]。丁斯予等[17]利用Miseq高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃海刺參(Apostichopusjaponicus)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與渤海的不同；陸振[18]利用MiSeq高通量測序技術(shù),也發(fā)現(xiàn)大連、煙臺、霞浦和莆田地區(qū),養(yǎng)殖仿刺參(Apostichopusjaponicus)腸道微生物豐度和優(yōu)勢類群存在較大差異；王軼南等[19]的研究表明,養(yǎng)殖海參腸道中的微生物群落結(jié)構(gòu)與其棲息沉積環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)具有相似之處[20]。上述研究說明海參腸道微生物組成反映了海參攝食途徑、沉積物營養(yǎng)水平和棲息環(huán)境。

雅浦海溝具有“V”形構(gòu)造(越靠近底部越陡峭),促進(jìn)了海溝上部顆粒物沿海溝側(cè)壁向下沉降,使海溝底部營養(yǎng)物質(zhì)匯集,而海溝側(cè)坡營養(yǎng)相對匱乏[21]。這種地形特征,限制海底平原生物向海溝下潛,導(dǎo)致該區(qū)域生物量相對較低[22]。郭承秧等[9]研究發(fā)現(xiàn)雅浦海溝真光層中的浮游植物、浮游動物與大型底棲生物相比,碳、氮的穩(wěn)定同位素比率(‰)(δ13C和δ15N)差異超過了1個營養(yǎng)級,這說明作為底棲生物初始食物來源的浮游植物和浮游動物在向下輸送的過程中,經(jīng)歷了食物鏈傳遞和細(xì)菌的降解過程。由于雅浦海溝底棲生物的營養(yǎng)來源相對匱乏,微生物可能是主要、直接的能量來源。而目前雅浦海溝海參及其腸道微生物研究未見報(bào)道。

2017-06-13,我國載人深潛器“蛟龍”號在執(zhí)行38航次152潛次雅浦海溝科學(xué)考察中,于6 622 m海底捕獲一只海參。本研究利用MiSeq高通量測序技術(shù)對其腸道微生物多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析,研究結(jié)果可為超深淵環(huán)境物質(zhì)能量循環(huán)及生命進(jìn)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017-06-13“蛟龍”號深潛器在雅浦海溝(137°84′E,8°30′N)水深6 622 m 處海域進(jìn)行采集(圖1a),水溫1.7℃,采集后獲得海參,回收上船時由于壓力的變化,體壁已爆裂,僅有完整的腸道和部分體壁組織(圖1b)。將回收樣本直接置于液氮中,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。養(yǎng)殖海參于2018-12在青島黃海海域的黃島濱海海參養(yǎng)殖場采集(120°18′E,35°97′N),采集海域水深2 m,水溫10℃；采集樣品大小均勻、色澤正常、體質(zhì)健康且體表無損傷(圖1c)；樣品采集后直接置于液氮中,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

圖1 雅浦海溝海參和黃海養(yǎng)殖海參Fig.1 Sea cucumber from the Yap Trench and from aquaculture in the Yellow Sea

1.2 樣品處理

在實(shí)驗(yàn)室采用無菌生理鹽水(0.9%)分別沖洗雅浦海溝海參(YP-SPE)體壁和黃海養(yǎng)殖海參(BY)表皮后,采用無菌解剖刀剖開海參體壁,將體壁組織置于無菌離心管中,用于提取海參基因組。取雅浦海溝海參和2只黃海養(yǎng)殖海參的腸道內(nèi)容物,分別編號為YP-SPE-1,B5-A1和B6-B1,用于提取腸道微生物基因組。

1.3 海參基因組提取及基因擴(kuò)增

分別取海參體壁組織30 mg,使用海洋動物DNA提取試劑盒(天根,北京)提取總DNA,采用紫外可見分光光度計(jì)(BioSpectrometer?basic,Eppendorf)檢測DNA濃度和純度,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小和提取的完整性。分別利用16SA-F/16SB-R[23]引物和COIe-F/COIe-R[24]引物對16S核糖體小亞基基因(16S rDNA)和細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因(COI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)采用的DNA聚合酶為TransStartTMTaq DNA Polymerase(全式金,北京),PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性60 s；95℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸80 s,40個循環(huán)；72℃延伸10 min[25]。PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

使用DNA Star軟件中的Clustal W將基因擴(kuò)增片段與GenBank中近緣序列進(jìn)行多重比對,使用MEGA 6.0軟件的相鄰連接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自舉值設(shè)為1 000。將測序原始序列提交到NCBI,獲得序列號為：MH572268,MK002697,MN401255和MN427946。

1.4 腸道細(xì)菌、古菌16S rDNA基因擴(kuò)增

分別取腸道內(nèi)容物200 mg,使用糞便DNA提取試劑盒(天根,北京)提取總DNA,采用紫外可見分光光度計(jì)(BioSpectrometer?basic,Eppendorf)檢測DNA濃度和純度,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小和提取的完整性。利用338F/806R[26]引物對細(xì)菌16S r DNA的V3-V4可變區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[27],擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,27個循環(huán)；72℃延伸10 min。利用524F/958R[28]引物對古菌16S r DNA的V4-V5可變區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[28]。通過Illumina公司MiseqPE300平臺進(jìn)行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中(序列號：SAMN13705046～SAMN13705049)。本研究所有擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控,FLASH軟件進(jìn)行拼接：1)設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,需窗口前端位置截去該堿基后端所有序列,再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；2)根據(jù)重疊堿基將兩端序列進(jìn)行拼接,拼接時重疊堿基之間的最大錯配率為0.2,長度需大于10 bp；3)根據(jù)序列首尾兩端的標(biāo)簽和引物將序列拆分至每個樣本,標(biāo)簽需精確匹配,引物允許2個堿基的錯配,去除存在模糊堿基的序列。使用UPARSE軟件(version7.1,http：∥drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行分類操作單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)聚類,在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(Ribosomal Database Project classifier,http：∥rdp.cme.msu.edu/)對OTUs里的每一條代表序列(默認(rèn)豐度最高)進(jìn)行物種分類注釋,比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123),設(shè)置比對閾值為70%。基于分類結(jié)果統(tǒng)計(jì)各樣品中微生物類群相對豐度。

1.6 Alpha多樣性分析

使用Mothur軟件分析序列的覆蓋率和Alpha多樣性。Alpha多樣性包括：豐富度實(shí)際觀測值(the Observed Richness,Sobs)、ACE指數(shù)(ACE Index)、Chao1指數(shù)(Chao1 Index)、辛普森指數(shù)(Simpson Index)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index),其中香農(nóng)和辛普森指數(shù)可估計(jì)樣本群落多樣性,ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)可估計(jì)樣本群落豐富度。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參的分子鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過引物擴(kuò)增獲得了458 bp的16S r DNA基因片段和558 bp的COI基因片段。系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明,基于16S rDNA基因序列片段(圖2),雅浦海溝海參(YP-SPE)與來自深海環(huán)境的海參聚為一個分支,并與辛那參科(Synallactidae)的粗?jǐn)M刺參(Pseudostichopusvillosus)的進(jìn)化關(guān)系最近(相似度為99.1%),其次為Molpadiodemasinvolutus(相似度98.2%)；黃海養(yǎng)殖海參(BY)與近海養(yǎng)殖場的海參聚為1個分支,親緣關(guān)系較近,其中與同仿刺參(Apostichopusjaponicus)進(jìn)化關(guān)系最近,相似度高于99.4%。基于COI基因序列片段(圖3),雅浦海溝海參(YP-SPE)與低溫高壓深海環(huán)境的辛那參科(Synallactidae)的海參聚為一個分支,與Molpadiodemasmorbillus的進(jìn)化關(guān)系最近,相似度為96.4%,與雅浦海溝海參親緣關(guān)系較近的其它2個分支中也均來自于深海環(huán)境；養(yǎng)殖海參(BY)與4只近海養(yǎng)殖海參聚為1個大分支(圖3)。綜合考慮,本研究將采集的雅浦海溝海參鑒定為辛那參科(Synallactidae)。雅浦海溝海參的16S r DNA和COI基因序列與黃海養(yǎng)殖海參的相似度不高,分別為79.8%和92.3%,說明它們的進(jìn)化關(guān)系差異與基因序列差異有關(guān)。

圖2 基于海參16S r DNA基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree of sea cucumbers based on 16S r DNA gene sequences

圖3 基于海參COI基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree of sea cucumbers based on COI gene sequences

2.2 海參腸道微生物多樣性

2.2.1 海參腸道微生物16S r DNA測序結(jié)果

雅浦海溝海參和2只黃海養(yǎng)殖海參腸道的細(xì)菌16S r DNA的原始序列為41 575～50 733條,古菌為90 102條。經(jīng)質(zhì)量控制、去除單序列和嵌合體之后,獲得有效序列分別為35 935～42 405條和78 883條。有效序列百分比均達(dá)80%以上,達(dá)到后續(xù)微生物多樣性分析的要求。雅浦海溝海參和黃海養(yǎng)殖海參腸道細(xì)菌16S r DNA序列的平均長度分別為459.6,420.0和420.7 bp；古菌16S r DNA序列的平均長度為448.2 bp。

2.2.2 海參腸道微生物的Alpha多樣性

雅浦海溝海參和黃海養(yǎng)殖海參腸道微生物測序覆蓋率為99.7%～99.9%,表明測序結(jié)果代表樣本真實(shí)情況。在OTU水平上(97%),2個采樣區(qū)域的海參腸道微生物測序稀釋曲線均趨于平坦,說明測序深度足以反映微生物多樣性。雅浦海溝海參腸道細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和辛普森指數(shù)均比養(yǎng)殖海參腸道細(xì)菌的低,表明雅浦海溝海參較養(yǎng)殖海參的腸道細(xì)菌多樣性和菌群豐度低(表2)。

表2 雅浦海溝海參和養(yǎng)殖海參腸道細(xì)菌及古菌(OTU,97%)Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of bacteria and archaea(OTU,97%)of sea cucumber intestines from the Yap Trench and the Yellow Sea

2.3 細(xì)菌組成

雅浦海溝海參腸道細(xì)菌共獲得18個門、36個綱、80個目、107個科、140個屬和206個種；養(yǎng)殖海參腸道的細(xì)菌共獲得23個門、48個綱、122個目、157個科、238個屬和211個種。

雅浦海溝海參腸道細(xì)菌主要為變形菌門(Proteobacteria,55.2%),包括：γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,34.1%),α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,16.0%),δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,4.9%)。其次為擬桿菌門(Bacteroidetes,24.3%),浮霉菌狀門(Planctomycetes,9.0%),放線菌門(Actinobacteria,3.7%)和硝化螺菌門(Nitrospirae,1.8%)等(圖4)。

養(yǎng)殖海參腸道微生物優(yōu)勢類群也為變形菌門(Proteobacteria,平均76.2%),包括：δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,平均28.1%),γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,平均23.7%),α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,平均12.1%),ε-變形菌綱(Epsilonbacteraeota,平均13.7%),其次為擬桿菌門(Bacteroidetes,平均9.0%),放線菌門(Actinobacteria,平均4.0%),綠彎菌門(Chloroflexi,平均3.3%)和酸桿菌門(Acidobacteria,平均2.0%)(圖4)等。變形菌門和擬桿菌門是2個區(qū)域海參腸道主要的微生物類群。

圖4 雅浦海溝和黃海海參腸道細(xì)菌組成Fig.4 Composition of bacteria of sea cucumber intestines from the Yap Trench and the Yellow Sea

2.3.1 變形菌門(Proteobacteria)

1)γ-變形菌(Gammaproteobacteria)

在雅浦海溝海參腸道微生物中,γ-變形菌綱占絕對優(yōu)勢。γ-變形菌綱也是近海海參腸道中最主要且普遍存在的類群[29-32],在促進(jìn)養(yǎng)殖環(huán)境中的碳、氮循環(huán)中具有重要作用[33]。雅浦海溝海參腸道中γ-變形菌的豐度高于黃海養(yǎng)殖海參的,這主要由于β-變形桿菌目(Betaproteobacteriales)的嗜甲基細(xì)菌甲基嬌養(yǎng)桿菌屬(Methylotenera)占總豐度的10.6%。Kalyuhznaya等[34]和Bec等[35]研究發(fā)現(xiàn)甲基嬌養(yǎng)桿菌屬的甲醇代謝與反硝化過程密切相關(guān)。通過16S r DNA序列相似度比對和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖5),發(fā)現(xiàn)來源于深海蟹類腸道[36]、海洋河口沉積物[37]以及深海烴滲出沉積物[38]的4株細(xì)菌16S r DNA序列與雅浦海溝海參腸道的甲基嬌養(yǎng)桿菌屬代表菌株(MethyloteneramobilisYP-SPE-1)16S r DNA序列聚為1個進(jìn)化分支,而與污染環(huán)境中7株細(xì)菌的16S r DNA序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在β-變形桿菌目中,雅浦海溝海參腸道的亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae,1.4%)豐度也高于黃海養(yǎng)殖海參(平均0.03%)的豐度。據(jù)報(bào)道亞硝化單胞菌目中的微生物可將氨氧化為亞硝酸鹽,在氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[39]。

圖5 基于Methylotenera 16S rDNA基因片段的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Methylotenera based on 16S rDNA gene sequences

γ-變形菌綱中Halieaceae科在黃海養(yǎng)殖海參中豐度最高,平均值為7.3%,主要包括海球菌(Halioglobus,6.2%)；在雅浦海溝海參腸道中,僅占0.2%。海球菌也普遍存在于其他養(yǎng)殖海參(如仿刺參)以及海洋沉積物中[12-13]。

2)α-變形菌(Alphaproteobacteria)

雅浦海溝海參腸道的α-變形菌主要包括小棒菌目(Parvibaculales,3.9%),紅細(xì)桿菌目(Rhodobacterales,3.3%),紅弧菌目(Rhodovibrionales,1.9%)和根瘤菌目(Rhizobiales,2.2%)；黃海養(yǎng)殖海參腸道的α-變形菌主要為紅細(xì)桿菌目(Rhodobacterales,7.0%)。

3)δ-變形菌(Deltaproteobacteria)

黃海養(yǎng)殖海參腸道微生物δ-變形菌主要包括脫硫盒菌目(Desulfarculales),脫硫桿菌目(Desulfobacterales),脫硫單胞菌目(Desulfuromonadales)及脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)的硫酸鹽還原菌,總豐度平均為28.1%,脫硫盒菌目脫硫葉菌屬(Desulfobulbus,10.2%)豐度較高；而δ-變形菌在雅浦海溝海參腸道中總豐度平均僅為4.9%。研究表明硫卵形菌屬以乳酸、乙醇、丙酮酸及其他脂肪酸為電子受體和能源物質(zhì)將硫酸鹽還原為硫化氫并產(chǎn)生乙酸,屬于不完全氧化型的硫酸鹽還原菌[40]。

4)ε-變形菌(Epsilonproteobacteria)

黃海養(yǎng)殖海參腸道微生物ε-變形菌平均豐度為13.7%,由硫卵形菌屬(Sulfurovum)構(gòu)成。硫卵形菌屬可以單質(zhì)硫、硫化物和硫代硫酸鹽作為電子供體,以硝酸鹽作為電子受體,進(jìn)行化能自養(yǎng)過程[41-42]。在雅浦海溝海參腸道中未發(fā)現(xiàn)硫卵形菌屬。

2.3.2 擬桿菌門(Bacteroidetes)

Cottrell,Kirchman[43]和Osullivan[44]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門與脂類、蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化密切相關(guān),在維持宿主腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用[45]。雅浦海溝海參腸道中擬桿菌門豐度高于黃海養(yǎng)殖海參的擬桿菌門豐度,其中幾丁質(zhì)噬菌體目(Chitinophagales,12.2%)和黃桿菌目(Flavobacteriales,10.7%)為主要類群,可以將氧化二氮還原為氮?dú)?參與反硝化過程[46]。

2.3.3 浮霉菌門(Planctomycetes)

雅浦海溝海參腸道中,浮霉菌門豐度占9.0%,其中浮霉菌綱(Phycisphaerae)為5.4%；在黃海養(yǎng)殖海參腸道中浮霉菌門僅占0.03%。研究表明浮霉菌剛細(xì)菌在活性污泥中參與脫氮作用[47]。

2.3.4 放線菌門(Actinobacteria)

放線菌在有機(jī)質(zhì)分解和礦化作用的過程中起重要作用[48],黃海養(yǎng)殖海參腸道微生物的放線菌豐度高于雅浦海溝海參腸道微生物的放線菌豐度,其中沉積巖桿菌屬(Ilumatobacter)占絕對優(yōu)勢,且該屬也在河口和海濱沙灘分布[49-50],可以利用檸檬酸,葡萄糖,麥芽糖等多種碳源進(jìn)行生長代謝。

2.3.5 硝化螺菌門(Nitrospirae)和硝化刺菌門(Nitrospinae)

雅浦海溝海參腸道中分布硝化螺菌門(Nitrospirae,1.8%)和硝化刺菌門(Nitrospinae,0.8%),而在黃海養(yǎng)殖海參腸道中未檢測到。這2個類群是黑暗海洋中化能自養(yǎng)的亞硝酸鹽氧化菌最主要的類群[51-53]。

2.4 微生物古菌組成

雅浦海溝海參腸道古菌共獲得奇古菌門、泉古菌門和廣古菌門三個門,包括6個綱,9個目,14個科,16個屬,18個種。其中,奇古菌門豐度高達(dá)98.8%,主要由氨氧化古菌亞硝化侏儒菌屬(Nitrosopumilus,95.6%)組成。氨氧化古菌廣泛分布于海洋和陸地生境,可以將氨氧化成亞硝酸鹽,是黑暗海洋中最豐富的化能自養(yǎng)類群之一[54-58],在全球氮循環(huán)中具有重要作用。

本研究從GeneBank中選取雅浦海溝海參腸道亞硝化侏儒菌屬代表菌株(NitrosopumilusYP-SPE-1)的16S r DNA近緣序列,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖6),亞硝化侏儒菌屬(NitrosopumilusYP-SPE-1)與來自超深淵或深海沉積物的3株古菌聚為一個小分支；而與非深海海洋環(huán)境中4株菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；來自陸地的3株菌株聚為一個獨(dú)立分支,位于進(jìn)化樹的基部。

圖6 基于Nitrosopumilus 16S rDNA基因片段的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Nitrosopumilus based on 16S r DNA gene sequences

3 討 論

雅浦海溝等超深淵環(huán)境具有獨(dú)特的“V”形地質(zhì)構(gòu)造、水動力環(huán)境及物質(zhì)循環(huán)和能量流動體系,具有相比其他大洋環(huán)境更高的有機(jī)碳等生源要素的沉降通量和儲碳效率,是海洋初級生產(chǎn)的巨大“捕獲器”和有機(jī)碳的沉積匯。雅浦海溝還是連接深部生物圈與海洋的窗口和通道,在海洋和全球碳循環(huán)中扮演重要角色[5]。研究雅浦海溝超深淵生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)過程、生物形態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能將有助于加深人類對超深淵系統(tǒng)的認(rèn)識。

通過生物的進(jìn)化關(guān)系分析,JAMIESON等[59]發(fā)現(xiàn)即使在相鄰近的海溝,同種類生物(如,海參和片腳類等)也具有獨(dú)特的特征,表明不同海域海溝生物群落在地理空間上的特異性[59]。本研究通過構(gòu)建16S r DNA和COI基因片段的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,分析了雅浦海溝超深淵海參與和養(yǎng)殖海參的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。在對雅浦海溝超深淵海參與養(yǎng)殖海參基于16S r DNA和COI基因序列的相似度和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對比后發(fā)現(xiàn),超深淵與近海地理隔離造成了物種差異,這種基因序列的差異可能是導(dǎo)致生物形成獨(dú)特特征的原因。

雅浦海溝微生物的系統(tǒng)進(jìn)化特征,也反映了地理空間特異性。甲基嬌養(yǎng)桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,甲基嬌養(yǎng)桿菌(MethyloteneraYP-SPE-1)與深海環(huán)境中的3株甲基嬌養(yǎng)桿菌(2株來自深海蟹類腸道)親緣關(guān)系最近,而與人為污染環(huán)境中甲基嬌養(yǎng)桿菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。亞硝化侏儒菌系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明,亞硝化侏儒菌(NitrospumilusYP-SPE-1)與深海沉積物的亞硝化侏儒菌屬親緣關(guān)系最近,其次為近海來源的亞硝化侏儒菌屬,而與陸源的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。Ren等[60]通過構(gòu)建了奇古菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,推斷出氨氧化古菌(Ammon-Oxidizing Archaea,AOA)進(jìn)化的3個階段：1)起源于陸地上的非AOA的奇古菌；2)在淺海海水定殖；3)向深海海水?dāng)U張。本研究系統(tǒng)進(jìn)化樹的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),陸地沉積物中的奇古菌位于進(jìn)化樹的基部,進(jìn)化程度最古老,其次為近海沉積物和海水,進(jìn)化程度最晚的分支來源于盆地和深海沉積環(huán)境。本研究的進(jìn)化分支與Ren等[60]構(gòu)建的水環(huán)境奇古菌3大進(jìn)化分支相一致,因此,我們推斷沉積環(huán)境中的氨氧化古菌進(jìn)化也遵循從陸地到深海進(jìn)化的理論,這也證實(shí)并補(bǔ)充了Ren等[60]的理論。

海參腸道微生物為宿主提供營養(yǎng)來源[20],也反映了宿主棲息環(huán)境的微生物組成[14-15]。雅浦海溝海參腸道古菌中,奇古菌門相對豐度達(dá)98.8%,其中,氨氧化古菌亞硝化侏儒菌高達(dá)95.6%。Zhang等[6]利用宏基因組測序手段,研究了雅浦海溝微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝特性,也發(fā)現(xiàn)奇古菌門豐度達(dá)41%～49%。由此可見,雅浦海溝海參腸道中的奇古菌門反映了棲息環(huán)境氨氧化類群的分布特征以及氨氧化生成亞硝酸鹽的化能自養(yǎng)過程。雅浦海溝海參腸道中還發(fā)現(xiàn)了硝化螺菌門(Nitrospirae)和硝化刺菌門(Nitrospinae),可通過亞硝酸鹽氧化進(jìn)行碳固定作用。雅浦海溝海參腸道微生物中,化能自養(yǎng)的硝酸鹽還原菌甲基嬌養(yǎng)桿菌屬為γ-變形菌綱的優(yōu)勢類群。在α-變形菌綱、擬桿菌門、浮霉菌門等類群中也發(fā)現(xiàn)多種自養(yǎng)和異養(yǎng)的硝酸鹽還原菌。何高陽等[8]發(fā)現(xiàn)子囊菌門和擔(dān)子菌門中的硝酸鹽還原類群在雅浦海溝沉積物可培養(yǎng)真菌中占優(yōu)勢。本研究未對黃海養(yǎng)殖海參腸道的古菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增和分析,但雅浦海溝海參腸道微生物宏基因組數(shù)據(jù)中,亞硝化侏儒菌豐度較高,而在養(yǎng)殖海參腸道微生物宏基因組數(shù)據(jù)中,并未發(fā)現(xiàn)亞硝化侏儒菌序列(未發(fā)表數(shù)據(jù)),說明亞硝化侏儒菌不是養(yǎng)殖海參腸道的主要微生物類群。我們推測,雅浦海溝環(huán)境中的化能自養(yǎng)微生物,通過氨氧化、亞硝酸鹽氧化和硝酸鹽還原作用,完成氮的循環(huán)過程,這些化能自養(yǎng)的類群還通過暗固碳作用合成有機(jī)物,這可能是寡營養(yǎng)的生存環(huán)境中能量的高效獲取機(jī)制,也在全球氮循環(huán)中起著重要作用。這些微生物類群同時為海參提供了食物來源,將物質(zhì)和能量向更高一級食物鏈傳遞。

黃海養(yǎng)殖海參腸道微生物硫酸鹽還原菌(δ-變形菌綱)和硫卵形菌屬(ε-變形菌綱)的豐度均高于雅浦海溝海參的,這可能反映了近岸富營養(yǎng)的沉積物中硫的循環(huán)過程。氮循環(huán)和硫循環(huán)在超深淵和近海海參腸道微生物中的差異,指示了棲息環(huán)境物質(zhì)循環(huán)和能量流動的特征。

4 結(jié) 語

本研究首次分析了雅浦海溝海參及其腸道微生物多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化特征,為揭示超深淵環(huán)境的物質(zhì)能量循環(huán)及生命進(jìn)化提供理論參考。

雅浦海溝海參及其腸道微生物均與深海環(huán)境種類的親緣關(guān)系最近,而與陸棲環(huán)境或近海環(huán)境的物種親緣關(guān)系遠(yuǎn),這反映了超深淵與近海環(huán)境地理隔離導(dǎo)致的基因序列及進(jìn)化選擇的差異性。根據(jù)亞硝化侏儒菌的16S r DNA進(jìn)化樹,我們推斷沉積環(huán)境中的氨氧化奇古菌也同海水中的一樣,遵循從陸地到深海環(huán)境進(jìn)化的理論。根據(jù)腸道微生物種類,推斷可知,雅浦海溝中的化能自養(yǎng)微生物,通過氨氧化,亞硝酸鹽氧化和反硝化作用,完成氮的循環(huán)過程,在全球氮循環(huán)中起著重要作用；而近海富營養(yǎng)的沉積環(huán)境促進(jìn)了硫酸鹽的還原及硫的氧化過程。未來需要獲得更多數(shù)量及不同種類的超深淵底棲生物進(jìn)行深入研究,從而更全面地認(rèn)識超深淵底棲生物腸道微生物的多樣性,及其與極端環(huán)境的相互作用機(jī)制。