骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松的防治作用及機(jī)制探討

張念軍 區(qū)作明,3 李雪 陳茹 王昌兵 劉少華 湯琪 楊海韻 鄧向亮

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院骨十科，廣東 佛山 528000 3.佛山市高明區(qū)中醫(yī)院骨科，廣東 佛山 528500 4.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 佛山 528300 5.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨骼系統(tǒng)疾病，臨床上以骨量、骨密度損失等為主要特征，多見(jiàn)于中老年人，尤以絕經(jīng)后女性為甚，成為21世紀(jì)的第5大疾病[1]。我國(guó)是OP發(fā)病的大國(guó)，隨著我國(guó)人口老齡化的進(jìn)一步加劇，據(jù)預(yù)測(cè)，2020年我國(guó)將有近3億OP患者， 約占世界的50%以上[2]。OP主要分為三大類：原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]。其中，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最為常見(jiàn)，又可分為Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)及Ⅱ型骨質(zhì)疏松癥即老年性骨質(zhì)疏松癥；原發(fā)性骨質(zhì)疏松中，PMOP占大多數(shù)[3]。女性在絕經(jīng)后即開(kāi)始出現(xiàn)骨量丟失的增加，絕經(jīng)后5～10年是骨丟失的高峰期。佛山市中醫(yī)院使用骨寶丸治療骨質(zhì)疏松癥，取得了較好的臨床療效。骨寶丸主要由熟地、仙茅、山萸肉、淫羊藿、淮山藥、龜板、當(dāng)歸等藥物組成，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、健脾胃、益氣血的功效[4]。經(jīng)臨床應(yīng)用30余年，證實(shí)骨寶丸對(duì)骨質(zhì)疏松、骨折愈合遲緩、股骨頭無(wú)菌性壞死及肝腎虧損諸癥，有理想的臨床療效[5-9]。然而目前的研究多以臨床療效評(píng)價(jià)為主，缺乏相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn)，尤其是作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)尚未清楚。因此，本研究參考文獻(xiàn)用維甲酸誘導(dǎo)小鼠以建立骨質(zhì)疏松模型，考察骨寶丸對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松的防治作用，并從骨形成的角度探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物：SPF級(jí)健康BALB/c小鼠30只，雌性，體質(zhì)量 18～22 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要藥物與試劑：骨寶丸(佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，粵藥制字Z20060052，由熟地、仙茅、山萸肉、淫羊藿、淮山藥、龜板、當(dāng)歸等10多種藥物組成)；維甲酸，為美倫生物科技有限公司生產(chǎn)；小鼠骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、血清Ⅰ型原膠原N-端前肽(procollagen type 1 N-peptide，P1NP)ELISA 試劑盒，均為博奧森生物公司生產(chǎn)；小鼠骨特異性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)ELISA 試劑盒由CUSABIO公司生產(chǎn)。

1.1.3主要儀器： Micro-CT(Aloka Latheta LCT200，Hitachi-Aloka)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan FC，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與造模：小鼠分成 5組，即正常組(Control)、模型組(Model)、骨寶丸高劑量組(GBW-H)、骨寶丸中劑量組(GBW-M)和骨寶丸低劑量組(GBW-L)，每組6只。實(shí)驗(yàn)第 1～30 天，除正常組給予RO水之外，其余各組小鼠灌服維甲酸造模，劑量為100 mg/kg，每天一次，連續(xù)30 d。

1.2.2動(dòng)物給藥：按人每天服用劑量的10倍劑量作為小鼠給藥的中劑量(即3 g/kg)，分別以中劑量組的2倍、1/2倍劑量作為高劑量(6 g/kg)和低劑量(1.5 g/kg)。實(shí)驗(yàn)第 1天開(kāi)始，骨寶丸各劑量組小鼠分別灌胃給予對(duì)應(yīng)劑量的藥物溶液，給藥體積為 0.2 mL/10 g，每天1 次，連續(xù)30 d；正常組和模型組給予等量RO水。

1.2.3觀察股骨形態(tài)：取小鼠股骨，稱取質(zhì)量，利用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量股骨中間段直徑和股骨長(zhǎng)度；取股骨經(jīng)10%中性甲醛固定、5%甲酸脫鈣，然后按常規(guī)方法制備石蠟切片，并進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織形態(tài)，并拍照。

1.2.4檢測(cè)骨密度(bone mineral density，BMD)：利用Micro-CT掃描小鼠股骨，計(jì)算BMD(mg/cm3)。

1.2.5ELISA檢測(cè)：摘眼球取血至干凈的EP管，樣品在室溫靜置20 min，然后離心(800 g，20 min)，分離血清后按照ELISA試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)血清中BMP-2、OC、BALP、P1NP的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用 Graphpad 5制作統(tǒng)計(jì)圖，并利用其自帶的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠股骨形態(tài)的影響

與正常組比較，模型組小鼠的股骨在形態(tài)上發(fā)生以下變化：肉眼觀察表面顏色顯枯白色、股骨頭變細(xì)(圖1)，股骨直徑和質(zhì)量均顯著減小(P<0.01，圖1B、1C)，股骨長(zhǎng)度未見(jiàn)顯著變化(圖1D)；這提示維甲酸造成小鼠股骨形態(tài)發(fā)生了較顯著的改變。與模型組比較，骨寶丸各劑量組小鼠的股骨形態(tài)有較大改善，其中肉眼觀察骨形態(tài)較粗壯，并呈現(xiàn)淡紅色(圖1 A)；股骨頭、骨質(zhì)量和股骨直徑均顯著大于模型組(P<0.01或P<0.05，圖1B、圖1C)。

圖1 小鼠股骨形態(tài) A：股骨形態(tài)；B：股骨直徑(橫徑)；C：股骨質(zhì)量；D：股骨長(zhǎng)度；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig.1 Morphology of mouse femur. A: morphology of the femur; B: diameter of the femurs (Transverse diameter); C: weight of the femurs; D: length of the femurs; Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01.

圖2 骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的小鼠股骨組織的影響(×100)Fig.2 Effect of GBW on the tissue of femur in retinoic-induced mice (×100)

2.2 對(duì)小鼠股骨組織的影響

本研究利用HE染色法觀察小鼠股骨組織變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，正常組小鼠的骨髓組織豐富而內(nèi)含大量的骨髓細(xì)胞，而模型組的骨髓組織顯著減少；與模型組比較，骨寶丸各劑量組的骨髓組織顯著增多。由于正常的骨髓組織內(nèi)含大量骨髓細(xì)胞，其中包括部分紅細(xì)胞，這使正常的股骨表面隱隱顯現(xiàn)淡紅色，因此結(jié)果也可以部分解釋了模型組小鼠的股骨經(jīng)肉眼觀察顯枯白色的原因。

2.3 對(duì)股骨密度的影響

BMD是骨質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志，反映骨質(zhì)疏松程度，預(yù)測(cè)骨折危險(xiǎn)性的重要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組的BMD顯著降低(P<0.05)；而與模型組比較，骨寶丸各劑量組的BMD有不同程度的升高，其中高、中劑量組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的小鼠股骨BMD的影響(與模型組比較，*P<0.01)Fig.3 Effect of GBW on the BMD of femur in tretinoin-induced mice (Compared with model group, **P<0.01)

2.4 對(duì)血清OC和P1NP分泌的影響

血清中OC和P1NP是反映骨形成的標(biāo)志物，在絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松婦女中這兩個(gè)指標(biāo)都會(huì)存在升高的現(xiàn)象，因此成為評(píng)價(jià)絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA試劑盒檢測(cè)了小鼠血清中OC和P1NP的分泌水平。結(jié)果顯示，模型組血清中OC和P1NP水平顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組相比，骨寶丸各劑量組OC和P1NP水平含量有不同程度降低：其中，骨寶丸各劑量組OC水平呈一定的劑量依賴性降低，且與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05，圖4 A)；同時(shí)，骨寶丸中、高劑量組的P1NP水平顯著低于模型組(P<0.01或0.05，圖4B)。

2.5 對(duì)血清BMP-2和BALP分泌的影響

為了進(jìn)一步探討骨寶丸防治維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松形成的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA試劑盒檢測(cè)了小鼠血清中BMP-2和骨形成分化標(biāo)志酶BALP的分泌水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，模型組小鼠血清中BMP-2和BALP分泌水平均顯著低于正常組(**P<0.01)；而骨寶丸各劑量組小鼠血清BMP-2和BALP分泌水平都不同程度地高于模型組的，其中骨寶丸各劑量組小鼠血清BMP-2分泌水平與模型組的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01，圖5 A)，骨寶丸高、中劑量組小鼠血清BALP分泌水平與模型組的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01，圖5B)。

圖4 骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的小鼠血清OC(A)和P1NP(B)分泌水平的影響(與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01)Fig.4 Effect of GBW on the secretion of OC (A) and P1NP (B) in the serum of tretinoin-induced mice (Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01)

圖5 骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的小鼠血清BMP-2(A)和BALP(B)分泌水平的影響(與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01)Fig.5 Effect of GBW on the secretion of BMP-2 (A) and BALP (B) in the serum of tretinoin-induced mice (Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01)

3 討論

本研究考察骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)小鼠制備骨質(zhì)疏松的影響，并從影響骨形成角度入手探討其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松有顯著的防治作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)股骨形成有關(guān)。

PMOP在原發(fā)性骨質(zhì)疏松中所占比例較高，因此無(wú)論是臨床還是實(shí)驗(yàn)研究均較多。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，卵巢切除和維甲酸誘導(dǎo)是制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的常用方法，其中維甲酸誘導(dǎo)具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、動(dòng)物無(wú)死亡等優(yōu)點(diǎn)，所以本研究參考文獻(xiàn)方法采用維甲酸誘導(dǎo)小鼠制備骨質(zhì)疏松模型[10-11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維甲酸誘導(dǎo)的小鼠股骨質(zhì)量、密度、直徑、骨髓組織均顯著減少，而且血清中骨代謝標(biāo)志物OC和P1NP 分泌水平顯著升高，而促進(jìn)骨形成相關(guān)蛋白BMP-2和BALP分泌水平顯著降低。本研究結(jié)果與臨床報(bào)道的PMOP具有較高的一致性，即PMOP為高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松，除了具有骨質(zhì)疏松的一般特性，還因?yàn)楣寝D(zhuǎn)換活躍，同時(shí)存在亢進(jìn)的骨吸收與骨形成，臨床可見(jiàn)骨代謝標(biāo)志物OC和P1NP 分泌水平升高[12-13]。

佛山市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑骨寶丸臨床治療骨質(zhì)疏松有很好的療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明骨寶丸能拮抗維甲酸誘導(dǎo)的小鼠股骨質(zhì)量、密度、直徑、骨髓組織減少，該結(jié)果與臨床報(bào)道的骨寶丸有改善PMOP患者骨密度、減少骨量丟失的功效相吻合[6]，同時(shí)與骨寶丸提高卵巢切除誘發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度的實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示骨寶丸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松有防治作用。為進(jìn)一步探討骨寶丸防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，本研究考察了小鼠血清中骨形成相關(guān)代謝物OC、P1NP、BMP-2和BALP的分泌水平。結(jié)果表明骨寶丸可拮抗維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠血清中OC和P1NP的分泌。OC和P1NP是敏感性好、特異性高的骨形成標(biāo)志物，一般反映骨細(xì)胞活性及骨功能狀態(tài)，然而PMOP作為高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松，骨形成和骨吸收都較為活躍，臨床報(bào)道患者血清OC和P1NP會(huì)出現(xiàn)升高[12-14]，其中骨形成和骨吸收都會(huì)釋放OC，這可能是OC在PMOP中升高的主要原因[15]。此外，本研究結(jié)果還顯示骨寶丸可拮抗維甲酸對(duì)小鼠血清BALP和BMP-2的抑制作用。BMP是一類與骨組織生長(zhǎng)相關(guān)的多功能糖蛋白，BMP-2是其中誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的蛋白之一[16]；BALP是由成骨細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，具有促進(jìn)骨組織的生成作用，是骨形成的標(biāo)志物之一[17]； BMP-2 通過(guò)促進(jìn)BALP 分泌，誘導(dǎo)BMSCs 向骨形成分化[18]。通過(guò)局部植入BMP-2不但可以促進(jìn)骨折愈合[19]，還能改善骨質(zhì)疏松動(dòng)物的骨質(zhì)[20]。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示骨寶丸防治維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松可能與促進(jìn)骨形成有關(guān)。

綜上所述，骨寶丸可防治維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松，其作用機(jī)制可能與保護(hù)BMP-2及其下游調(diào)控分子BALP分泌進(jìn)而促進(jìn)骨形成有關(guān)。