英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞后的轉(zhuǎn)錄組分析

吳坤鐘，李榮松，曹 陽，黃志君，田 鈴

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院/廣東省農(nóng)業(yè)動物功能基因組學與分子育種重點實驗室/廣東省蠶桑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

李斯特菌屬Listeria是革蘭陽性菌，隸屬厚壁菌門Firmicutes芽孢桿菌綱Bacilli芽孢桿菌目Bacillales，該屬包括17個種。狹義上的李斯特菌屬包括6個種，即單增李斯特菌L.monocytogenes、綿羊李斯特菌L.ivanovii、威爾斯李斯特菌L.welshimeri、默氏李斯特菌L.murrayi、西爾李斯特菌L.seeligeri和英諾克李斯特菌L.innocua，公認的致病菌只有2種，即單增李斯特菌和綿羊李斯特菌[1-2]。其中單增李斯特菌致病性最強，可導致人與動物患李斯特菌病[3]。綿羊李斯特菌又稱伊氏李斯特菌，僅能引起動物李斯特菌病[4]，但也有引起人患李斯特菌病的個別案例[2]。此外，非常罕見英諾克李斯特菌和西爾李斯特菌引起人李斯特病的報道，且二者不具有溶血活性，因此它們一般被認為是非致病菌。其中，英諾克李斯特菌常伴隨單增李斯特菌出現(xiàn)，并被視為后者的指示菌[5]。李斯特菌屬成員的中間宿主范圍較廣，常常生存于蔬菜、乳類和肉類制品中；適應性強，在2～42 ℃均能正常生長[6-7]。李斯特菌病的潛伏期一般小于24 h[8]，臨床表現(xiàn)為腦膜炎、菌血癥、眼內(nèi)炎、頸淋巴結(jié)炎、膽囊炎、骨髓炎及關(guān)節(jié)炎等，易感人群為老人、孕婦、新生兒和免疫缺陷患者[9]。在動物中，由綿羊李斯特菌引起的李斯特菌病可表現(xiàn)為流產(chǎn)、敗血癥等，但不引起腦膜炎[10]。鑒于李斯特菌有危害性大、宿主譜廣和適應性強的特點，很多國家都已經(jīng)采取相關(guān)措施防控食品中李斯特菌的污染，一些發(fā)達國家如美國等已將李斯特菌病定為法定傳染病，但目前我國僅在部分省市對李斯特菌病開展相關(guān)檢測工作[11]。

目前對李斯特菌的研究多集中在單增李斯特菌上，對其他李斯特菌的研究較少。已知的單增李斯特菌毒力因子主要有溶血素基因hly編碼的李斯特溶血素 O(Listerriolysin O，LLO)、plcA編碼的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Phospholipase C，PIPLC)、plcB基因編碼的磷脂酰膽堿磷脂酶(Phosphatidylcholine-specific phospholipase C，PCPLC)、SmcL基因編碼的神經(jīng)磷脂酶C(Nerve phoshpolipase C，NPI-PLC)、肌動蛋白 A (Actin A，Act A)、內(nèi)化素 (Internalins，Inl)和細胞壁水解酶(p60)[12]。其中LLO是重要的毒力因子，相對分子質(zhì)量為60 000，是一種孔成形毒素，與細胞膜表面分子結(jié)合后可以直接插入細胞膜上，是李斯特菌逃逸初級吞噬和雙層膜吞噬體所必須的毒力因子[13-14]。此外，LLO還可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的細胞因子表達，從而誘導樹突細胞凋亡。當李斯特菌借助細胞內(nèi)吞侵入宿主細胞后被包裹在吞噬體中，隨后李斯特菌分泌LLO和PI-PLC裂解吞噬體膜，從而逃逸進入宿主細胞漿中[15]。但此時，李斯特菌仍存在被宿主細胞自噬所清除的危險，而Act A在李斯特菌從宿主胞質(zhì)中逃逸的過程中發(fā)揮著重要的作用[16]。Act A是一種表面蛋白，當李斯特菌逃出吞噬體進入細胞漿中時，Act A可以模仿Wiskott-Aldrich綜合征蛋白 (Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP)機制，調(diào)用宿主細胞自身的肌動蛋白，這些肌動蛋白在李斯特菌一端形成1條彗星狀的尾巴，賦予李斯特菌在胞質(zhì)中運動的能力，并向鄰近的細胞遷移，實現(xiàn)細胞間侵染[17]。Act A還可以與宿主細胞中的Ena/VASP和Arp2/3復合體相結(jié)合，以此逃避宿主細胞的自噬識別系統(tǒng)[18]。

研究表明，英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的關(guān)系密切，兩者可能具有共同的毒力祖先，在進化過程中英諾克李斯特菌丟失了編碼主要毒力因子的基因[19]。英諾克李斯特菌在基因組上與單增李斯特菌非常相似，例如兩者都有300多個編碼運輸?shù)鞍椎幕?，包?0多個碳轉(zhuǎn)運蛋白，兩者都含有糖酵解所必需的酶[20]。典型的英諾克李斯特菌已在進化過程中缺失了LIPI-1毒力島，但Johnson等[21]和Moura等[22]研究發(fā)現(xiàn)某些天然非典型英諾克李斯特菌株卻含有完整的LIPI-1毒力島，這類菌株具有溶血活性，可以主動穿過腸上皮，傳播到肝臟和脾臟，但危害程度遠低于單增李斯特菌。由于英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的親緣關(guān)系最為接近，所以在一些食品的研究中，英諾克李斯特菌常常作為單增李斯特菌的替代菌種[23]。例如，Sorrentino等[24]發(fā)現(xiàn)在低pH條件下3?苯基乳酸可以抑制英諾克李斯特菌的生長。另外Tremonte等[25]發(fā)現(xiàn)，英諾克李斯特菌在面對酸脅迫時會顯著上調(diào)普遍脅迫蛋白(Universal stress protein，USP)基因的表達，表明在抵御酸脅迫時USP基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

目前，李斯特菌引起的相關(guān)并發(fā)癥尚無特效藥，也鮮有其侵染后寄主基因組水平的詳細反應情況的研究報道。由于典型的英諾克李斯特菌被認為是非致病菌[26]，人們對宿主與其互作的機制關(guān)注較少。鑒于英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的親緣關(guān)系最近，我們?nèi)绻軌蛏钊胪诰蚱淝秩竞笏拗骰虮磉_的變化情況，將為宿主調(diào)控、防御單增李斯特菌的危害提供對比與參考。利用英諾克李斯特菌可以侵染果蠅Drosophila melanogasterS2細胞的特性，我們在英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞3 h后，對果蠅S2細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序。

1 材料與方法

1.1 細胞與菌株的培養(yǎng)

英諾克李斯特菌(ATCC，33090，由上海海洋大學提供)用李斯特菌培養(yǎng)基(HB4160，海博生物技術(shù)有限公司)活化和培養(yǎng)。果蠅S2細胞(由中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所提供)在含有體積分數(shù)為5%胎牛血清(FBS500-S，AusGeneX，澳大利亞)的 Insect SIM SF 培養(yǎng)基 (MSF1-1，信和生物公司)中培養(yǎng)。

1.2 英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞

果蠅S2細胞鋪板培養(yǎng)18 h后，用50 nmol/L水溶性膽固醇 (134428，BIOBERRY)孵育 30 min。

試驗組處理：膽固醇孵育30 min后加入英諾克李斯特菌懸浮液(約20個細菌)在28 ℃條件下孵育1.5 h。然后用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌果蠅S2 細胞，在含 100 μmol/L CuSO4和 10 μg/mL 慶大霉素的Insect SIM SF培養(yǎng)基基中繼續(xù)培養(yǎng)果蠅S2細胞3 h。對照組處理：不加英諾克李斯特菌懸浮液，其他操作同試驗組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集試驗組和對照組果蠅S2細胞進行后續(xù)試驗。

1.3 RNA的抽提及轉(zhuǎn)錄組測序

用 TRIzol試劑 (9108-1，Takara，日本)抽提感染英諾克李斯特菌后的果蠅S2細胞中的總RNA。使用 2100 Bioanalyze(Agilent Technologies，美國)定量總RNA模板。通過凝膠電泳確定每個樣品中總RNA的完整性。根據(jù)濃度和質(zhì)量值，分別選取試驗組與對照組3個最好的RNA樣品用于文庫制備和Illumina Novaseq 6000測序。原始配對的末端讀數(shù)修整后由SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)使用默認參數(shù)進行質(zhì)量控制。然后使用TopHat軟件 (http://tophat.cbcb.umd.edu/，版本2.1.1)以定向模式將原始的讀數(shù)與參考基因組比對。根據(jù)每百萬條映射片段中每千個堿基的轉(zhuǎn)錄本所包含的片段 (Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM)計算每個轉(zhuǎn)錄本的表達水平。使用RSEM軟件(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)定量基因豐度。R統(tǒng)計軟件包EdgeR(http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html)用于基因差異表達分析。此外，使用Goatools(https://github.com/tanghaibao/Goatools)和 KOBAS 2.1.1 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)進行GO和KEGG分析。對照組和試驗組樣品均設(shè)置3個生物學重復。

1.4 實時定量PCR檢測

對差異基因進行qPCR驗證：用TRIzol試劑分別提取對照組與試驗組果蠅S2細胞的總RNA，使用 PrimeScriptTM RT 試劑盒 (RR047A，Takara，日本)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進行qPCR檢測。以果蠅的rp49基因作為內(nèi)參基因。對照組和試驗組樣品均設(shè)置3個生物學重復。

利用qPCR對英諾克李斯特菌的增殖情況進行檢測：英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞3 h后，收集果蠅S2細胞，用基因組提取試劑盒(D3129-01，Magen)提取總基因組，以此為模板，以果蠅rp49基因作為內(nèi)參基因，用英諾克李斯特菌的凋亡抑制蛋白 (Inhibitor of apoptosis protein，IAP)基因特異性引物進行qPCR檢測英諾克李斯特菌的增殖情況[27]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Office Excel2010 軟件繪圖。試驗組和對照組的差異顯著性通過t檢驗進行統(tǒng)計分析。

按以下公式計算每個基因的差異表達倍數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 英諾克李斯特菌在果蠅S2細胞內(nèi)的增殖情況

利用qPCR對英諾克李斯特菌的增殖情況進行檢測，結(jié)果表明，英諾克李斯特菌的IAP基因拷貝數(shù)劇烈上升，果蠅S2細胞中侵染了大量的英諾克李斯特菌(圖1)。因此，我們在英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞3 h后收集果蠅S2細胞提取總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測序以及后續(xù)的qPCR驗證。

2.2 果蠅S2細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評估

對照組和試驗組分別平均產(chǎn)生了59 125 670和 60 779 885 條原始數(shù)據(jù)，錯誤率均在 0.025 6% 以下(表1)。果蠅S2細胞被英諾克李斯特菌侵染前基因組的GC質(zhì)量分數(shù)在50%左右，被侵染3 h后基因組GC質(zhì)量分數(shù)變化不大(表1)。對照組和試驗組的3次生物學重復之間的相關(guān)性系數(shù)均在0.994 9以上，表明各組之間重復性良好，可進行下一步分析。

圖1 英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞3 h后英諾克李斯特菌增殖情況Fig.1 Proliferation ofListeria innocua after its infection in Drosophila S2 cells for three hours

表1 果蠅S2細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Table 1 Statistics of transcriptome sequencing data forDrosophila S2 cells

2.3 果蠅S2細胞基因表達差異

英諾克李斯特菌侵染宿主果蠅S2細胞3 h后，韋恩分析表明對照組與試驗組共同表達的基因有7 808個，僅在試驗組表達的基因有98個，僅在對照組表達的基因有187個。

與對照組相比，試驗組共有54個基因呈現(xiàn)顯著性差異(上/下調(diào)倍數(shù)≥2)，其中21個基因上調(diào)，33個基因下調(diào)，變化幅度最大的是DmCR46081，上調(diào)了232倍，其次是DmDef(DmDefensin)、DmDro(DmDrosomycin)、DmDpt A(DmDptericin A)和DmDpt B(DmDptericin B)等抗菌肽基因。DmCR46081基因編碼rRNA前體加工蛋白，提示果蠅S2細胞被英諾克李斯特菌侵染后某些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平大幅度提升(表2)。

2.4 果蠅S2細胞差異表達基因的功能注釋分析

GO注釋分析顯示，21個上調(diào)的基因共涉及10個GO條目，可分為生物進程、細胞組分和分子功能3大類，其中富集基因數(shù)目最多的GO條目分別是胞外區(qū)(9個)、應激反應(5個)、代謝進程(4個)、免疫系統(tǒng)進程(4個)、多細胞生物進程(3個)、催化活性 (3個)、結(jié)合 (3個)、細胞進程(1個)、細胞成分組織或生物合成(1個)、胞外區(qū)組件 (1 個)(表 3)。

下調(diào)的33個基因共涉及22個GO條目，其中富集基因數(shù)最多的GO條目分別是催化活性(11個)、代謝進程(10個)、細胞膜(10個)、單組織進程(8個)、細胞膜組件(8個)、結(jié)合(8個)、細胞進程(7 個)、定位 (6 個)、細胞 (6 個)、細胞組件 (6 個)、細胞器(4個)、細胞器組件(3個)、大分子復合物(3個)、轉(zhuǎn)錄活性(3個)、排毒(1個)、生物進程調(diào)控(1個)、多細胞組織進程(1個)、生物調(diào)控(1個)、應激反應(1個)、胞外區(qū)(1個)、抗氧化活性(1個)、電子轉(zhuǎn)運活性(1個)(表4)。

結(jié)果顯示，上調(diào)基因多集中在胞外區(qū)，下調(diào)基因多集中在代謝進程、細胞膜和催化活性，說明被英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細胞的某些代謝反應下降。

表3 英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細胞上調(diào)基因GO注釋Table 3 GO annotation of upregulated genes inDrosophila S2 cells afterListeriainnocua infection

2.5 果蠅S2細胞差異表達基因的富集分析

2.5.1 上調(diào)基因 KEGG 富集 KEGG 富集分析表明，顯著上調(diào)的21個基因只注釋到1個KEGG 通路，即Toll/Imd通路(P<0.001)，包括4個果蠅抗菌肽基因DmDpt A、DmDef、DmCec A2(Cecropin A2)和DmCec B(Cecropin B)。

2.5.2 下調(diào)基因 KEGG 富集 KEGG 富集分析結(jié)果(表5)表明，下調(diào)的33個基因注釋到23個KEGG 通路。

表5 英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細胞下調(diào)基因KEGG富集表Table 5 KEGG enrichment of downregulated genes inDrosophila S2 cells afterListeriainnocua infection

2.6 免疫相關(guān)通路中的基因分析

英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞后的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)GO注釋和KEGG富集分析顯示，顯著上調(diào)的基因主要與免疫相關(guān)。從24個KEGG通路中篩選出10個與免疫相關(guān)的KEGG 通路，分別是Toll/Imd通路、類風濕關(guān)節(jié)炎、吞噬體、霍亂弧菌感染、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導、NOD樣受體信號通路、鉑耐藥、結(jié)核、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、mTOR信號通路，共涉及到8個基因，其中上調(diào)幅度最大的是DmDef，上調(diào)了9.805倍，下調(diào)幅度最大的是DmDhd，下調(diào)了4.329倍。

2.7 果蠅S2細胞轉(zhuǎn)錄組中抗菌肽的qPCR驗證

英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞后，變化最為顯著的基因類群為抗菌肽。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞3 h后共10個抗菌肽基因顯著上調(diào)，包括DmDef、DmDro、DmDpt A、DmDpt B、DmCec A2、DmCec B、DmMtk(DmMetchnikowin)、DmAtt D(DmAttacin D)、DmAtt A(DmAttacin A)、DmAtt B(DmAttacin B)，其中上調(diào)幅度最大的是DmDef(表2)。

我們選取9個抗菌肽基因，利用qPCR進行了驗證，其中上調(diào)幅度最大的是DmMtk，上調(diào)8.180 倍，DmAtt A上調(diào) 7.533 倍，DmDro上調(diào)7.204 倍，DmDef上調(diào) 4.569 倍 (圖 2)，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的趨勢基本一致，說明英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞后，抗菌肽基因受到顯著的誘導表達。

圖2 免疫相關(guān)基因表達的qPCR驗證結(jié)果Fig.2 qPCR verification results for expression of immune related genes

3 討論與結(jié)論

已知的果蠅免疫信號通路有3條，分別是Toll通路、Imd通路和JAK/STAT通路。果蠅雖然沒有獲得性免疫，但是依然能對不同病原菌的入侵做出不同的先天免疫反應，革蘭陽性菌和真菌所引起的免疫反應主要由Toll通路介導，而革蘭陰性菌和細胞壁含DAP型肽聚糖的陽性菌引起的免疫反應主要由Imd通路介導[28-29]。Toll通路或Imd通路被激活后可誘導下游抗菌肽的表達[30]。已知的果蠅抗菌肽主要有7種，分別是Attacin、Diptericin、Drosocin、Defensin、Cecropin、Metchnikowin 和Drosomycin?？咕牡谋磉_由Toll和Imd通路調(diào)控，若Toll通路和Imd通路缺失，將不能誘導抗菌肽的表達[31-33]。

英諾克李斯特菌屬于革蘭陽性菌，其細胞壁肽聚糖成分主要為DAP型肽聚糖[34]，DAP型肽聚糖可以激活果蠅的Imd通路。已有研究表明，果蠅的PGRP-SD作為胞外受體不參與Toll通路，而是參與Imd通路的激活[35]。本研究發(fā)現(xiàn)DmPGRPSD出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細胞后Imd通路可能被激活?？咕腁ttacin、Cecropin和Diptericin的表達主要受Imd通路的調(diào)控[36-37]，本研究結(jié)果顯示果蠅的抗菌肽基因DmAtt A、DmAtt B、DmAtt D和DmCec A2和DmCec B均出現(xiàn)顯著上調(diào)，顯示了Imd通路的激活。而抗菌肽 Drosomycin、Defensin和Metchnikowin的表達主要受Toll通路調(diào)控[38]，本研究結(jié)果中顯示果蠅的抗菌肽基因DmDro、DmDef和DmMtk也出現(xiàn)了顯著上調(diào)，提示英諾克李斯特菌可能同時引起了Imd和Toll通路的激活，但具體是Toll通路還是Imd通路起主要作用，則需要進一步的研究?？咕谋徽J為具有廣譜性，但Hanson等[39]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽針對某些病原微生物具有特異性，Imd通路調(diào)控的抗菌肽對單增李斯特菌并不起作用[34]。Hanson等[39]研究還發(fā)現(xiàn)果蠅的spz基因缺失后對英諾克李斯特菌表現(xiàn)出極高的敏感性，提示在抵御英諾克李斯特菌的過程中，Toll通路調(diào)控的抗菌肽起重要作用。鑒于上述研究結(jié)果和單增李斯特菌與英諾克李斯特菌相近的親緣關(guān)系，猜測宿主在抵御英諾克李斯特菌和單增李斯特菌侵染的過程中Toll通路調(diào)控的抗菌肽可能起到關(guān)鍵作用，但Toll通路的激活機制需要進一步深入研究。

英諾克李斯特菌作為一種胞內(nèi)寄生菌，通過內(nèi)吞作用侵入宿主細胞后會被包裹在吞噬體中，英諾克李斯特菌在宿主細胞中的增殖需要它從宿主的吞噬體中逃逸至細胞質(zhì)中，我們注意到液泡型H+離子腺苷三磷酸酶 (Vacuolar H+-ATPase，VATPase)基因DmVha68-3和DmVha100-4均出現(xiàn)了顯著下調(diào)，KEGG富集結(jié)果顯示它們富集到吞噬體等通路中。DmVha68-3編碼果蠅V-ATPase-A亞基，DmVha100-4編碼V-ATPase-a亞基，為VATPase復合體形成的關(guān)鍵亞基[40]，V-ATPase廣泛存在于細胞器膜上，如內(nèi)體、溶酶體及吞噬體膜，可以將H+泵入這些細胞器中以維持這些細胞器的相對酸性內(nèi)環(huán)境，促進細胞器對內(nèi)吞或是細胞自噬包裹的底物或是入侵的微生物進行降解[41-42]。單增李斯特菌的毒力因子LLO正常發(fā)揮作用時需要酸性環(huán)境，在pH 5.6時LLO的溶血活性最高，當pH超過7.0時LLO的活性基本喪失[43]。典型的英諾李斯特菌缺失毒力島，而其侵染果蠅S2細胞后上述2個DmV-ATPase基因的下調(diào)是否跟毒力島缺失有關(guān)目前尚不清楚，值得我們今后深入思考。此外，是否可以通過調(diào)控宿主細胞的V-ATPase活性從而抑制單增李斯特菌毒力因子LLO的活性對其進行防控，也是有益的思考。