英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組分析

吳坤鐘，李榮松，曹 陽(yáng)，黃志君，田 鈴

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物功能基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省蠶桑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

李斯特菌屬Listeria是革蘭陽(yáng)性菌，隸屬厚壁菌門(mén)Firmicutes芽孢桿菌綱Bacilli芽孢桿菌目Bacillales，該屬包括17個(gè)種。狹義上的李斯特菌屬包括6個(gè)種，即單增李斯特菌L.monocytogenes、綿羊李斯特菌L.ivanovii、威爾斯李斯特菌L.welshimeri、默氏李斯特菌L.murrayi、西爾李斯特菌L.seeligeri和英諾克李斯特菌L.innocua，公認(rèn)的致病菌只有2種，即單增李斯特菌和綿羊李斯特菌[1-2]。其中單增李斯特菌致病性最強(qiáng)，可導(dǎo)致人與動(dòng)物患李斯特菌病[3]。綿羊李斯特菌又稱(chēng)伊氏李斯特菌，僅能引起動(dòng)物李斯特菌病[4]，但也有引起人患李斯特菌病的個(gè)別案例[2]。此外，非常罕見(jiàn)英諾克李斯特菌和西爾李斯特菌引起人李斯特病的報(bào)道，且二者不具有溶血活性，因此它們一般被認(rèn)為是非致病菌。其中，英諾克李斯特菌常伴隨單增李斯特菌出現(xiàn)，并被視為后者的指示菌[5]。李斯特菌屬成員的中間宿主范圍較廣，常常生存于蔬菜、乳類(lèi)和肉類(lèi)制品中；適應(yīng)性強(qiáng)，在2～42 ℃均能正常生長(zhǎng)[6-7]。李斯特菌病的潛伏期一般小于24 h[8]，臨床表現(xiàn)為腦膜炎、菌血癥、眼內(nèi)炎、頸淋巴結(jié)炎、膽囊炎、骨髓炎及關(guān)節(jié)炎等，易感人群為老人、孕婦、新生兒和免疫缺陷患者[9]。在動(dòng)物中，由綿羊李斯特菌引起的李斯特菌病可表現(xiàn)為流產(chǎn)、敗血癥等，但不引起腦膜炎[10]。鑒于李斯特菌有危害性大、宿主譜廣和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，很多國(guó)家都已經(jīng)采取相關(guān)措施防控食品中李斯特菌的污染，一些發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)等已將李斯特菌病定為法定傳染病，但目前我國(guó)僅在部分省市對(duì)李斯特菌病開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)工作[11]。

目前對(duì)李斯特菌的研究多集中在單增李斯特菌上，對(duì)其他李斯特菌的研究較少。已知的單增李斯特菌毒力因子主要有溶血素基因hly編碼的李斯特溶血素 O(Listerriolysin O，LLO)、plcA編碼的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Phospholipase C，PIPLC)、plcB基因編碼的磷脂酰膽堿磷脂酶(Phosphatidylcholine-specific phospholipase C，PCPLC)、SmcL基因編碼的神經(jīng)磷脂酶C(Nerve phoshpolipase C，NPI-PLC)、肌動(dòng)蛋白 A (Actin A，Act A)、內(nèi)化素 (Internalins，Inl)和細(xì)胞壁水解酶(p60)[12]。其中LLO是重要的毒力因子，相對(duì)分子質(zhì)量為60 000，是一種孔成形毒素，與細(xì)胞膜表面分子結(jié)合后可以直接插入細(xì)胞膜上，是李斯特菌逃逸初級(jí)吞噬和雙層膜吞噬體所必須的毒力因子[13-14]。此外，LLO還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)，從而誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞凋亡。當(dāng)李斯特菌借助細(xì)胞內(nèi)吞侵入宿主細(xì)胞后被包裹在吞噬體中，隨后李斯特菌分泌LLO和PI-PLC裂解吞噬體膜，從而逃逸進(jìn)入宿主細(xì)胞漿中[15]。但此時(shí)，李斯特菌仍存在被宿主細(xì)胞自噬所清除的危險(xiǎn)，而Act A在李斯特菌從宿主胞質(zhì)中逃逸的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[16]。Act A是一種表面蛋白，當(dāng)李斯特菌逃出吞噬體進(jìn)入細(xì)胞漿中時(shí)，Act A可以模仿Wiskott-Aldrich綜合征蛋白 (Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP)機(jī)制，調(diào)用宿主細(xì)胞自身的肌動(dòng)蛋白，這些肌動(dòng)蛋白在李斯特菌一端形成1條彗星狀的尾巴，賦予李斯特菌在胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)的能力，并向鄰近的細(xì)胞遷移，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間侵染[17]。Act A還可以與宿主細(xì)胞中的Ena/VASP和Arp2/3復(fù)合體相結(jié)合，以此逃避宿主細(xì)胞的自噬識(shí)別系統(tǒng)[18]。

研究表明，英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的關(guān)系密切，兩者可能具有共同的毒力祖先，在進(jìn)化過(guò)程中英諾克李斯特菌丟失了編碼主要毒力因子的基因[19]。英諾克李斯特菌在基因組上與單增李斯特菌非常相似，例如兩者都有300多個(gè)編碼運(yùn)輸?shù)鞍椎幕?，包?0多個(gè)碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，兩者都含有糖酵解所必需的酶[20]。典型的英諾克李斯特菌已在進(jìn)化過(guò)程中缺失了LIPI-1毒力島，但Johnson等[21]和Moura等[22]研究發(fā)現(xiàn)某些天然非典型英諾克李斯特菌株卻含有完整的LIPI-1毒力島，這類(lèi)菌株具有溶血活性，可以主動(dòng)穿過(guò)腸上皮，傳播到肝臟和脾臟，但危害程度遠(yuǎn)低于單增李斯特菌。由于英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的親緣關(guān)系最為接近，所以在一些食品的研究中，英諾克李斯特菌常常作為單增李斯特菌的替代菌種[23]。例如，Sorrentino等[24]發(fā)現(xiàn)在低pH條件下3?苯基乳酸可以抑制英諾克李斯特菌的生長(zhǎng)。另外Tremonte等[25]發(fā)現(xiàn)，英諾克李斯特菌在面對(duì)酸脅迫時(shí)會(huì)顯著上調(diào)普遍脅迫蛋白(Universal stress protein，USP)基因的表達(dá)，表明在抵御酸脅迫時(shí)USP基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

目前，李斯特菌引起的相關(guān)并發(fā)癥尚無(wú)特效藥，也鮮有其侵染后寄主基因組水平的詳細(xì)反應(yīng)情況的研究報(bào)道。由于典型的英諾克李斯特菌被認(rèn)為是非致病菌[26]，人們對(duì)宿主與其互作的機(jī)制關(guān)注較少。鑒于英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的親緣關(guān)系最近，我們?nèi)绻軌蛏钊胪诰蚱淝秩竞笏拗骰虮磉_(dá)的變化情況，將為宿主調(diào)控、防御單增李斯特菌的危害提供對(duì)比與參考。利用英諾克李斯特菌可以侵染果蠅Drosophila melanogasterS2細(xì)胞的特性，我們?cè)谟⒅Z克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后，對(duì)果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與菌株的培養(yǎng)

英諾克李斯特菌(ATCC，33090，由上海海洋大學(xué)提供)用李斯特菌培養(yǎng)基(HB4160，海博生物技術(shù)有限公司)活化和培養(yǎng)。果蠅S2細(xì)胞(由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供)在含有體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清(FBS500-S，AusGeneX，澳大利亞)的 Insect SIM SF 培養(yǎng)基 (MSF1-1，信和生物公司)中培養(yǎng)。

1.2 英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞

果蠅S2細(xì)胞鋪板培養(yǎng)18 h后，用50 nmol/L水溶性膽固醇 (134428，BIOBERRY)孵育 30 min。

試驗(yàn)組處理：膽固醇孵育30 min后加入英諾克李斯特菌懸浮液(約20個(gè)細(xì)菌)在28 ℃條件下孵育1.5 h。然后用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌果蠅S2 細(xì)胞，在含 100 μmol/L CuSO4和 10 μg/mL 慶大霉素的Insect SIM SF培養(yǎng)基基中繼續(xù)培養(yǎng)果蠅S2細(xì)胞3 h。對(duì)照組處理：不加英諾克李斯特菌懸浮液，其他操作同試驗(yàn)組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集試驗(yàn)組和對(duì)照組果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 RNA的抽提及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

用 TRIzol試劑 (9108-1，Takara，日本)抽提感染英諾克李斯特菌后的果蠅S2細(xì)胞中的總RNA。使用 2100 Bioanalyze(Agilent Technologies，美國(guó))定量總RNA模板。通過(guò)凝膠電泳確定每個(gè)樣品中總RNA的完整性。根據(jù)濃度和質(zhì)量值，分別選取試驗(yàn)組與對(duì)照組3個(gè)最好的RNA樣品用于文庫(kù)制備和Illumina Novaseq 6000測(cè)序。原始配對(duì)的末端讀數(shù)修整后由SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制。然后使用TopHat軟件 (http://tophat.cbcb.umd.edu/，版本2.1.1)以定向模式將原始的讀數(shù)與參考基因組比對(duì)。根據(jù)每百萬(wàn)條映射片段中每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄本所包含的片段 (Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM)計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。使用RSEM軟件(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)定量基因豐度。R統(tǒng)計(jì)軟件包EdgeR(http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html)用于基因差異表達(dá)分析。此外，使用Goatools(https://github.com/tanghaibao/Goatools)和 KOBAS 2.1.1 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)進(jìn)行GO和KEGG分析。對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

對(duì)差異基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證：用TRIzol試劑分別提取對(duì)照組與試驗(yàn)組果蠅S2細(xì)胞的總RNA，使用 PrimeScriptTM RT 試劑盒 (RR047A，Takara，日本)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。以果蠅的rp49基因作為內(nèi)參基因。對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

利用qPCR對(duì)英諾克李斯特菌的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)：英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后，收集果蠅S2細(xì)胞，用基因組提取試劑盒(D3129-01，Magen)提取總基因組，以此為模板，以果蠅rp49基因作為內(nèi)參基因，用英諾克李斯特菌的凋亡抑制蛋白 (Inhibitor of apoptosis protein，IAP)基因特異性引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)英諾克李斯特菌的增殖情況[27]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Office Excel2010 軟件繪圖。試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異顯著性通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

按以下公式計(jì)算每個(gè)基因的差異表達(dá)倍數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 英諾克李斯特菌在果蠅S2細(xì)胞內(nèi)的增殖情況

利用qPCR對(duì)英諾克李斯特菌的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，英諾克李斯特菌的IAP基因拷貝數(shù)劇烈上升，果蠅S2細(xì)胞中侵染了大量的英諾克李斯特菌(圖1)。因此，我們?cè)谟⒅Z克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后收集果蠅S2細(xì)胞提取總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及后續(xù)的qPCR驗(yàn)證。

2.2 果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評(píng)估

對(duì)照組和試驗(yàn)組分別平均產(chǎn)生了59 125 670和 60 779 885 條原始數(shù)據(jù)，錯(cuò)誤率均在 0.025 6% 以下(表1)。果蠅S2細(xì)胞被英諾克李斯特菌侵染前基因組的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%左右，被侵染3 h后基因組GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大(表1)。對(duì)照組和試驗(yàn)組的3次生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性系數(shù)均在0.994 9以上，表明各組之間重復(fù)性良好，可進(jìn)行下一步分析。

圖1 英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后英諾克李斯特菌增殖情況Fig.1 Proliferation ofListeria innocua after its infection in Drosophila S2 cells for three hours

表1 果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistics of transcriptome sequencing data forDrosophila S2 cells

2.3 果蠅S2細(xì)胞基因表達(dá)差異

英諾克李斯特菌侵染宿主果蠅S2細(xì)胞3 h后，韋恩分析表明對(duì)照組與試驗(yàn)組共同表達(dá)的基因有7 808個(gè)，僅在試驗(yàn)組表達(dá)的基因有98個(gè)，僅在對(duì)照組表達(dá)的基因有187個(gè)。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組共有54個(gè)基因呈現(xiàn)顯著性差異(上/下調(diào)倍數(shù)≥2)，其中21個(gè)基因上調(diào)，33個(gè)基因下調(diào)，變化幅度最大的是DmCR46081，上調(diào)了232倍，其次是DmDef(DmDefensin)、DmDro(DmDrosomycin)、DmDpt A(DmDptericin A)和DmDpt B(DmDptericin B)等抗菌肽基因。DmCR46081基因編碼rRNA前體加工蛋白，提示果蠅S2細(xì)胞被英諾克李斯特菌侵染后某些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平大幅度提升(表2)。

2.4 果蠅S2細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能注釋分析

GO注釋分析顯示，21個(gè)上調(diào)的基因共涉及10個(gè)GO條目，可分為生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類(lèi)，其中富集基因數(shù)目最多的GO條目分別是胞外區(qū)(9個(gè))、應(yīng)激反應(yīng)(5個(gè))、代謝進(jìn)程(4個(gè))、免疫系統(tǒng)進(jìn)程(4個(gè))、多細(xì)胞生物進(jìn)程(3個(gè))、催化活性 (3個(gè))、結(jié)合 (3個(gè))、細(xì)胞進(jìn)程(1個(gè))、細(xì)胞成分組織或生物合成(1個(gè))、胞外區(qū)組件 (1 個(gè))(表 3)。

下調(diào)的33個(gè)基因共涉及22個(gè)GO條目，其中富集基因數(shù)最多的GO條目分別是催化活性(11個(gè))、代謝進(jìn)程(10個(gè))、細(xì)胞膜(10個(gè))、單組織進(jìn)程(8個(gè))、細(xì)胞膜組件(8個(gè))、結(jié)合(8個(gè))、細(xì)胞進(jìn)程(7 個(gè))、定位 (6 個(gè))、細(xì)胞 (6 個(gè))、細(xì)胞組件 (6 個(gè))、細(xì)胞器(4個(gè))、細(xì)胞器組件(3個(gè))、大分子復(fù)合物(3個(gè))、轉(zhuǎn)錄活性(3個(gè))、排毒(1個(gè))、生物進(jìn)程調(diào)控(1個(gè))、多細(xì)胞組織進(jìn)程(1個(gè))、生物調(diào)控(1個(gè))、應(yīng)激反應(yīng)(1個(gè))、胞外區(qū)(1個(gè))、抗氧化活性(1個(gè))、電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性(1個(gè))(表4)。

結(jié)果顯示，上調(diào)基因多集中在胞外區(qū)，下調(diào)基因多集中在代謝進(jìn)程、細(xì)胞膜和催化活性，說(shuō)明被英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細(xì)胞的某些代謝反應(yīng)下降。

表3 英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細(xì)胞上調(diào)基因GO注釋Table 3 GO annotation of upregulated genes inDrosophila S2 cells afterListeriainnocua infection

2.5 果蠅S2細(xì)胞差異表達(dá)基因的富集分析

2.5.1 上調(diào)基因 KEGG 富集 KEGG 富集分析表明，顯著上調(diào)的21個(gè)基因只注釋到1個(gè)KEGG 通路，即Toll/Imd通路(P<0.001)，包括4個(gè)果蠅抗菌肽基因DmDpt A、DmDef、DmCec A2(Cecropin A2)和DmCec B(Cecropin B)。

2.5.2 下調(diào)基因 KEGG 富集 KEGG 富集分析結(jié)果(表5)表明，下調(diào)的33個(gè)基因注釋到23個(gè)KEGG 通路。

表5 英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細(xì)胞下調(diào)基因KEGG富集表Table 5 KEGG enrichment of downregulated genes inDrosophila S2 cells afterListeriainnocua infection

2.6 免疫相關(guān)通路中的基因分析

英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)GO注釋和KEGG富集分析顯示，顯著上調(diào)的基因主要與免疫相關(guān)。從24個(gè)KEGG通路中篩選出10個(gè)與免疫相關(guān)的KEGG 通路，分別是Toll/Imd通路、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、吞噬體、霍亂弧菌感染、幽門(mén)螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、NOD樣受體信號(hào)通路、鉑耐藥、結(jié)核、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、mTOR信號(hào)通路，共涉及到8個(gè)基因，其中上調(diào)幅度最大的是DmDef，上調(diào)了9.805倍，下調(diào)幅度最大的是DmDhd，下調(diào)了4.329倍。

2.7 果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中抗菌肽的qPCR驗(yàn)證

英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后，變化最為顯著的基因類(lèi)群為抗菌肽。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后共10個(gè)抗菌肽基因顯著上調(diào)，包括DmDef、DmDro、DmDpt A、DmDpt B、DmCec A2、DmCec B、DmMtk(DmMetchnikowin)、DmAtt D(DmAttacin D)、DmAtt A(DmAttacin A)、DmAtt B(DmAttacin B)，其中上調(diào)幅度最大的是DmDef(表2)。

我們選取9個(gè)抗菌肽基因，利用qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證，其中上調(diào)幅度最大的是DmMtk，上調(diào)8.180 倍，DmAtt A上調(diào) 7.533 倍，DmDro上調(diào)7.204 倍，DmDef上調(diào) 4.569 倍 (圖 2)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后，抗菌肽基因受到顯著的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 免疫相關(guān)基因表達(dá)的qPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 qPCR verification results for expression of immune related genes

3 討論與結(jié)論

已知的果蠅免疫信號(hào)通路有3條，分別是Toll通路、Imd通路和JAK/STAT通路。果蠅雖然沒(méi)有獲得性免疫，但是依然能對(duì)不同病原菌的入侵做出不同的先天免疫反應(yīng)，革蘭陽(yáng)性菌和真菌所引起的免疫反應(yīng)主要由Toll通路介導(dǎo)，而革蘭陰性菌和細(xì)胞壁含DAP型肽聚糖的陽(yáng)性菌引起的免疫反應(yīng)主要由Imd通路介導(dǎo)[28-29]。Toll通路或Imd通路被激活后可誘導(dǎo)下游抗菌肽的表達(dá)[30]。已知的果蠅抗菌肽主要有7種，分別是Attacin、Diptericin、Drosocin、Defensin、Cecropin、Metchnikowin 和Drosomycin?？咕牡谋磉_(dá)由Toll和Imd通路調(diào)控，若Toll通路和Imd通路缺失，將不能誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)[31-33]。

英諾克李斯特菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁肽聚糖成分主要為DAP型肽聚糖[34]，DAP型肽聚糖可以激活果蠅的Imd通路。已有研究表明，果蠅的PGRP-SD作為胞外受體不參與Toll通路，而是參與Imd通路的激活[35]。本研究發(fā)現(xiàn)DmPGRPSD出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后Imd通路可能被激活。抗菌肽Attacin、Cecropin和Diptericin的表達(dá)主要受Imd通路的調(diào)控[36-37]，本研究結(jié)果顯示果蠅的抗菌肽基因DmAtt A、DmAtt B、DmAtt D和DmCec A2和DmCec B均出現(xiàn)顯著上調(diào)，顯示了Imd通路的激活。而抗菌肽 Drosomycin、Defensin和Metchnikowin的表達(dá)主要受Toll通路調(diào)控[38]，本研究結(jié)果中顯示果蠅的抗菌肽基因DmDro、DmDef和DmMtk也出現(xiàn)了顯著上調(diào)，提示英諾克李斯特菌可能同時(shí)引起了Imd和Toll通路的激活，但具體是Toll通路還是Imd通路起主要作用，則需要進(jìn)一步的研究?？咕谋徽J(rèn)為具有廣譜性，但Hanson等[39]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽針對(duì)某些病原微生物具有特異性，Imd通路調(diào)控的抗菌肽對(duì)單增李斯特菌并不起作用[34]。Hanson等[39]研究還發(fā)現(xiàn)果蠅的spz基因缺失后對(duì)英諾克李斯特菌表現(xiàn)出極高的敏感性，提示在抵御英諾克李斯特菌的過(guò)程中，Toll通路調(diào)控的抗菌肽起重要作用。鑒于上述研究結(jié)果和單增李斯特菌與英諾克李斯特菌相近的親緣關(guān)系，猜測(cè)宿主在抵御英諾克李斯特菌和單增李斯特菌侵染的過(guò)程中Toll通路調(diào)控的抗菌肽可能起到關(guān)鍵作用，但Toll通路的激活機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

英諾克李斯特菌作為一種胞內(nèi)寄生菌，通過(guò)內(nèi)吞作用侵入宿主細(xì)胞后會(huì)被包裹在吞噬體中，英諾克李斯特菌在宿主細(xì)胞中的增殖需要它從宿主的吞噬體中逃逸至細(xì)胞質(zhì)中，我們注意到液泡型H+離子腺苷三磷酸酶 (Vacuolar H+-ATPase，VATPase)基因DmVha68-3和DmVha100-4均出現(xiàn)了顯著下調(diào)，KEGG富集結(jié)果顯示它們富集到吞噬體等通路中。DmVha68-3編碼果蠅V-ATPase-A亞基，DmVha100-4編碼V-ATPase-a亞基，為VATPase復(fù)合體形成的關(guān)鍵亞基[40]，V-ATPase廣泛存在于細(xì)胞器膜上，如內(nèi)體、溶酶體及吞噬體膜，可以將H+泵入這些細(xì)胞器中以維持這些細(xì)胞器的相對(duì)酸性?xún)?nèi)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞器對(duì)內(nèi)吞或是細(xì)胞自噬包裹的底物或是入侵的微生物進(jìn)行降解[41-42]。單增李斯特菌的毒力因子LLO正常發(fā)揮作用時(shí)需要酸性環(huán)境，在pH 5.6時(shí)LLO的溶血活性最高，當(dāng)pH超過(guò)7.0時(shí)LLO的活性基本喪失[43]。典型的英諾李斯特菌缺失毒力島，而其侵染果蠅S2細(xì)胞后上述2個(gè)DmV-ATPase基因的下調(diào)是否跟毒力島缺失有關(guān)目前尚不清楚，值得我們今后深入思考。此外，是否可以通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞的V-ATPase活性從而抑制單增李斯特菌毒力因子LLO的活性對(duì)其進(jìn)行防控，也是有益的思考。