胃食管反流病大鼠模型探討

陳小蘇 王艷 鮑云 王艷娟 林琳 葉必星

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）為消化系統(tǒng)常見(jiàn)病之一，因胃十二指腸內(nèi)容物反流入食管引起反酸、燒心等癥狀[1]。2018年發(fā)表于Gut雜志的meta分析顯示GERD全球發(fā)病率為25%‐51.2%，并呈逐年升高趨勢(shì)[2]。

GERD可分為非糜爛性反流病(non‐erosive reflux disease，NERD)、糜爛性食管炎(erosive esophagitis，EE)和Barrett食管(Barrett`s esophagus，BE)三種類(lèi)型[3][4]。動(dòng)物模型對(duì)于人類(lèi)疾病的病因?qū)W、病理學(xué)，分子機(jī)制以及治療和預(yù)防至關(guān)重要，迄今為止，科研人員已用多種方法構(gòu)建了豬、狗、兔，鼠等GERD模型[5]。因鼠類(lèi)的基因組結(jié)構(gòu)、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、繁育過(guò)程、生化代謝途徑都與人類(lèi)接近，且大鼠的繁殖能力極快，容易取得、價(jià)錢(qián)便宜,大鼠容易受反流誘導(dǎo)發(fā)展成GERD；而小鼠造模相對(duì)困難，如不能耐受手術(shù)，小鼠食管較小；大動(dòng)物造模代價(jià)較大。盡管大鼠的食管與人類(lèi)的食管在角化和黏膜下腺體方面有很大不同，GERD模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要來(lái)源于大鼠[6,7]。本文綜述了GERD大鼠常見(jiàn)造模方法、優(yōu)缺點(diǎn)、存活率、成功率等。

一、急性GERD模型

1.完全幽門(mén)結(jié)扎術(shù)（total pyloric ligation）：1938年Selye等[8]首次用大鼠行完全幽門(mén)結(jié)扎術(shù)（見(jiàn)圖1），他們也首次提出了酸誘導(dǎo)的反流性食管炎的概念[9]。該術(shù)式的特點(diǎn)：幽門(mén)被完全結(jié)扎以后，胃排空受阻，胃液潴留，胃液可明顯反流入食管，引起急性酸性食管炎。缺點(diǎn)：該大鼠模型存活時(shí)間短，約1～2天,GERD是一種慢性病，因而對(duì)反流性食管炎的研究?jī)r(jià)值有限[9]。2003年Tugay M等用此模型研究了食管炎對(duì)食管平滑肌反應(yīng)性的影響[10]。

圖1 完全幽門(mén)結(jié)扎術(shù)

2.完全空腸結(jié)扎術(shù)（total jejunal ligation）：Tugay等[10]通過(guò)結(jié)扎距Treitz韌帶遠(yuǎn)端1 cm的空腸,建立混合性反流模型。術(shù)后24 h實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)食管炎表現(xiàn)。缺點(diǎn)：該模型只能短期觀察反流物對(duì)食管的急性損傷情況，不能很好地模擬人類(lèi)GERD的自然病程。由于混合反流比單純的酸反流產(chǎn)生更多的自由基，該模型可用于探討自由基介導(dǎo)食管損傷的機(jī)制及防治[11,12]。

3.外源性食管灌注液體（External esophageal perfusion，EEP）：Li等[13]在大鼠頸背部皮下包埋微滲透泵，在頸部高度將PE‐50導(dǎo)管置入大鼠食管中，這種泵把外源性膽汁（0.5%胎牛膽汁，pH7.4）小量持續(xù)灌注到大鼠食管，通過(guò)膽汁直接損傷食管黏膜來(lái)構(gòu)建急性GERD模型（見(jiàn)圖2）。這種微滲透泵灌注速度有2.5 ul/h，5 ul/h，10 ul/h。優(yōu)點(diǎn)：這種方法創(chuàng)傷小，術(shù)后恢復(fù)快，存活率高，成功率約100%。缺點(diǎn)：人食管炎是一個(gè)多因素的慢性過(guò)程,單純膽汁損傷食管黏膜,不完全符合GERD的自然規(guī)律.該模型一般用于食管黏膜損害和防御機(jī)制的研究,還可用于評(píng)價(jià)食管炎藥物療效[14]。

圖2 外源性食管灌注微滲透泵模式圖

二、慢性GERD模型

1.慢性單純性酸反流

（1）部分幽門(mén)結(jié)扎+前胃結(jié)扎術(shù)（Partial pyloric ligation+ligation of forestomach）N.Omura等[15]用18Fr Ne′laton導(dǎo)管部分結(jié)扎幽門(mén)，同時(shí)用2‐0絲線在前胃和腺胃之間結(jié)扎，這種方法可限制食物通過(guò)幽門(mén)、縮小胃容量、使胃內(nèi)容物反流入食管（見(jiàn)圖3）。優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)反流性食管炎約100%，3周存活率達(dá)90%。該模型有助于評(píng)估藥物對(duì)食管炎的作用以及食管黏膜對(duì)損傷的反應(yīng)。利用該模型，Sugawa T等[16]在2008年研究了胃食管反流病與支氣管哮喘的關(guān)系；Ishiyama F等[17]在2009年研究了外源性NO對(duì)食管損傷的作用；2014年日本學(xué)者Takeuchi K等[18]研究了酸/胃蛋白酶，前列腺素和氨基酸在反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）中的作用。此模型是目前使用較多的慢性酸反流動(dòng)物模型之一。值得一提的是，單純的酸反流并不會(huì)引起B(yǎng)E或食管腺癌[6]。

圖3 部分幽門(mén)結(jié)扎+前胃結(jié)扎術(shù)

（2）食管-胃成形術(shù)(esophagogastroplasty)：Attwood SE等[19]在8周齡雄性SD大鼠上行食管-胃成形術(shù)，通過(guò)在胃食管交界處做一個(gè)縱行的6 mm切口（全層切開(kāi)），將胃食管交界處均勻分成兩部分，然后橫向分層吻合來(lái)構(gòu)建胃食管反流模型（見(jiàn)圖4）。優(yōu)點(diǎn)：該模型能很好地模擬人類(lèi)反流[20]。Melo LL等[21]借助此模型研究胃反流對(duì)食管癌變的影響。

圖4 食管-胃成形術(shù)

（3）esophagus）：1962年LEVRATM等[22]在大鼠（見(jiàn)圖5）,胃食管交界處切斷食管，關(guān)閉胃殘端，將食管殘端吻合到幽門(mén)前的腺胃上（端側(cè)吻合）來(lái)構(gòu)建僅有胃酸反流入食管的模型。特點(diǎn)：該實(shí)驗(yàn)組11只大鼠術(shù)后4周均未出現(xiàn)食管炎的表現(xiàn)。

圖5 食管-幽門(mén)前吻合術(shù)

（4）賁門(mén)成形+幽門(mén)結(jié)扎+胃Roux‐en‐Y式吻合術(shù) （Cardioplasty+pyloric ligation+Roux‐en‐Y esophagojejunostomy）：國(guó)內(nèi)學(xué)者王雯等在大鼠上行賁門(mén)成形+幽門(mén)結(jié)扎+胃Roux‐en‐Y式吻合術(shù)構(gòu)建GERD模型（見(jiàn)圖6）。距幽門(mén)10 cm處切斷空腸，其遠(yuǎn)切端與腺胃的大彎側(cè)吻合，近切端吻合于距切斷緣約15 cm處的小腸側(cè)壁（端側(cè)吻合）。特點(diǎn)：該模型僅胃液反流入食管。術(shù)后4周食管炎發(fā)生率36.4%，死亡率37.1%。缺點(diǎn)：該模型術(shù)式復(fù)雜，大鼠死亡率高，成功率低[23]。

圖6 賁門(mén)成形+幽門(mén)結(jié)扎+胃Roux‐en‐Y式吻合術(shù)

2.慢性單純性堿反流模型

（1）食管-空腸吻合+全胃切除術(shù)（esophagojejunostomy with total gastrectomy）：Seto Y等[24]和Miwa K等[25]分別在1991年和1996年在8周齡雄性Wistar大鼠上行此術(shù)式（見(jiàn)圖7），即在胃食管交界處做橫向切口，在十二指腸與幽門(mén)交界處做縱向切口，切除全胃，關(guān)閉十二指腸殘端，然后在距Treitz韌帶以下約4 cm處，腸系膜對(duì)側(cè)做一縱行切口，將食管殘端進(jìn)行端側(cè)全層間斷吻合到空腸的切口上，該模型單獨(dú)將十二指腸內(nèi)容物通過(guò)吻合口引流到食管，構(gòu)建GERD模型，實(shí)驗(yàn)組中大鼠食管全部出現(xiàn)了潰瘍，RE模型大鼠成功率100%[26]。

圖7 食管-空腸吻合+全胃切除術(shù)

（2）食管-十二指腸吻合+全胃切除術(shù)（esophagoduodenostomy with total gastrectomy）:王雯等[23]在SD大鼠上（見(jiàn)圖8），結(jié)扎賁門(mén)，切斷食管，切除全胃；十二指腸殘端結(jié)扎并荷包包埋。距殘端約1 cm處腸系膜對(duì)側(cè)縱行切開(kāi)十二指腸壁約0.5 cm，與食管下端行端側(cè)吻合術(shù)。術(shù)后4周成活率為76.7%，RE發(fā)生率100%。該模型[27]產(chǎn)生的食管炎癥更重，容易誘發(fā)食管癌。缺點(diǎn)：大鼠術(shù)后體重下降。

圖8 食管-十二指腸吻合+全胃切除術(shù)

3.慢性混合反流模型

（1）食管-十二指腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)（side‐to‐side esophagoduodenostomy）：1992年Attwood SE等[19]在8周齡雄性SD大鼠（見(jiàn)圖9）靠近胃食管交界處上方做1 cm縱行切口，全層切開(kāi)食管，在距幽門(mén)1 cm附近的十二指腸近端腸系膜對(duì)側(cè)做1 cm切口，行側(cè)側(cè)吻合。該模型將胃、十二指腸內(nèi)容物引入食管，屬于以堿反流為主的混合反流模型[7]。Fang Y等[28]用此模型研究了胃食管反流對(duì)食管屏障功能的影響。Melo LL等[21]在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，結(jié)扎了胃食管交界處研究胃十二指腸內(nèi)容物對(duì)食管癌變的影響（見(jiàn)圖10）。

圖9 食管-十二指腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)

圖10 食管-十二指腸側(cè)側(cè)吻合+賁門(mén)結(jié)扎術(shù)

（2）食管-胃-十二指腸吻合術(shù)（esophagogastroduodenal anastomosis， EGDA）：Chen X等[29]在6周齡雄性SD大鼠上（見(jiàn)圖11），分別在胃食管連接處及幽門(mén)附近的十二指腸近端腸系膜對(duì)側(cè)做2個(gè)1.5 cm的縱向切口，全層間斷吻合切口。該模型成功率100%，存活率93%。它是目前最成功、最有效的GERD模型，將胃十二指腸內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到食管，但它無(wú)法控制回流物的量和濃度[7]。與其他GERD模型相比，EGDA優(yōu)點(diǎn)：①避免了其他手術(shù)并發(fā)癥，如胃功能喪失，營(yíng)養(yǎng)不良。食物沿正常消化道傳遞，EGDA大鼠營(yíng)養(yǎng)狀況正常；②胃和十二指腸內(nèi)容物大量回流到食道[29]。缺點(diǎn)：該模型會(huì)導(dǎo)致胃畸形，不能模擬自然發(fā)生的十二指腸反流。

圖11 食管-胃-十二指腸吻合術(shù)

（3）食管-十二指腸端側(cè)吻合+保留全胃術(shù)（end‐to‐side esophagoduodenostomy with gastric preservation）：Clark GW等[30]在8周齡SD大鼠上（見(jiàn)圖12）在胃食管交界處離斷食管，封閉胃殘端，在距離幽門(mén)1 cm遠(yuǎn)的十二指腸的腸系膜對(duì)側(cè)做一4 mm大小的縱向切口，將食管殘端全層間斷吻合到十二指腸上。該模型引起胃十二指腸內(nèi)容物反流到下段食管導(dǎo)致嚴(yán)重的食管炎癥。實(shí)驗(yàn)組15只大鼠（術(shù)后自由飲食組），存活13只，存活率為86.7%，存活的模型大鼠全有RE組織學(xué)表現(xiàn)（術(shù)后34周取材）。該術(shù)式不僅可構(gòu)建BE模型，也可研究誘發(fā)食管癌的因素缺點(diǎn)：該模型會(huì)出現(xiàn)手術(shù)相關(guān)的缺鐵性貧血等問(wèn)題[31]。1996年Ireland AP[32]等用此模型研究了胃液對(duì)大鼠食管腺癌的的作用。

圖12 食管-十二指腸端側(cè)吻合+保留全胃術(shù)

（4）食管-胃-空腸吻合術(shù)（esophagogastrojejunostomy）：H.Kumagai等[33]在雄性8周齡Wistar大鼠上行食管-胃-空腸吻合術(shù)來(lái)構(gòu)建GERD模型（見(jiàn)圖13），即在胃食管交界處和距離Treitz韌帶3 cm遠(yuǎn)端的腸系膜對(duì)側(cè)分別做1.5 cm的切口，然后側(cè)側(cè)全層間斷吻合，這樣胃液、十二指腸內(nèi)容物經(jīng)吻合口反流入食管。術(shù)后10周，實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)了食管炎以及BE組織學(xué)上的表現(xiàn)，隨著模型大鼠存活至50周，部分大鼠發(fā)展成了食管腺癌。缺點(diǎn)：①模型大鼠術(shù)后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良問(wèn)題如體重下降，血清鐵蛋白低，脂溶性維生素低；②強(qiáng)迫腸內(nèi)容物反流入食管，這和人類(lèi)生理和病理性反流不同。

圖13 食管-胃-空腸吻合術(shù)

（5）食管-空腸吻合+保留全胃術(shù)（esophagojejunostomy with gastricpreservation）：Kuan‐Hao Chen等[34]按照 Pera M 等[35]和 Miwa K等[25]在8周齡雄性Wistar大鼠（見(jiàn)圖14）胃食管交界處做橫向切口，關(guān)閉遠(yuǎn)端切口，在距Treitz韌帶約4 cm遠(yuǎn)處，腸系膜對(duì)側(cè)做一縱行切口，將食管近端切口進(jìn)行端側(cè)全層間斷吻合到空腸的切口上。該模型將胃、十二指腸內(nèi)容物（胃液、十二指腸液、胰液）引流到食管，構(gòu)建慢性反流性食管炎模型。優(yōu)點(diǎn)：食管空腸吻合減少了十二指腸內(nèi)容物反流量，也可構(gòu)建食管癌模型[35,36]。同時(shí)也是研究BE和食管腺癌發(fā)病機(jī)制的可靠模型[37]。

圖14 食管-空腸吻合+保留全胃術(shù)

（6）Roux‐en‐Y式食管-空腸吻合+保留全胃術(shù)(Roux‐en‐Y esophagojejunostomy without total gastrectomy)：1996年Miwa K等[25]行Roux‐en‐Y式食管-空腸吻合術(shù)+保留全胃術(shù)來(lái)構(gòu)建GERD模型。（見(jiàn)圖15），即在胃食管交界處做一橫切口，切斷食管，并用縫合線封閉遠(yuǎn)端切開(kāi)端（a）。從幽門(mén)和腺胃的交界處切斷十二指腸，縫合十二指腸殘端（b）。在距離Treitz韌帶約4 cm的遠(yuǎn)端將空腸橫切（靠近十二指腸端的斷端為近端，另一端為遠(yuǎn)端），并用縫合線封閉遠(yuǎn)端切開(kāi)端（c）。將胃殘端全層間斷吻合到靠近空腸遠(yuǎn)端切開(kāi)端的腸系膜對(duì)側(cè)（端側(cè)吻合），空腸環(huán)靠近縫合端（d）。將食管殘端吻合到空腸-胃吻合口遠(yuǎn)端約1 cm處的腸系膜對(duì)側(cè)（e）。最后，將空腸近端切口處與距離食管-空腸吻合口遠(yuǎn)端約4 cm處腸系膜對(duì)側(cè)行端側(cè)全層間斷吻合（f）。特點(diǎn)：此模型阻止了十二指腸內(nèi)容物（膽汁、胰液）反流入食管，僅使胃酸反流入食管[37,38]。

圖15 Roux‐en‐Y式食管-空腸吻合+保留全胃術(shù)

（7）食管空腸吻合+胃空腸吻合術(shù)（esophagojejunostomy+gastrojejunostomy）： Zhang T等[39]在6周齡SD雄性大鼠上（見(jiàn)圖16）在距幽門(mén)5 mm處離斷十二指腸，關(guān)閉十二指腸殘端，將胃殘端吻合到距離Treitz韌帶約4 cm遠(yuǎn)處腸系膜對(duì)側(cè)，在胃食管交界處上方2 mm處，離斷食管，關(guān)閉胃殘端，在距離胃空腸吻合口5 mm遠(yuǎn)處將食管殘端吻合到腸系膜對(duì)側(cè)（端側(cè)吻合），該模型比食管空腸吻合或食管十二指腸吻合更能模擬GERD的病理生理狀態(tài)，可作為BE研究的動(dòng)物模型[40]。

圖16 食管空腸吻合+胃空腸吻合術(shù)

此外，我國(guó)學(xué)者還構(gòu)建了完全結(jié)扎幽門(mén)+賁門(mén)肌切開(kāi)術(shù)[41]；賁門(mén)鋼圈置入固定術(shù)[42]；不同管徑內(nèi)支架支撐幽門(mén)及前胃結(jié)扎術(shù)[43]；全胃切除術(shù)+食管十二指腸端側(cè)吻合術(shù)+膽管空腸吻合術(shù)[44]等模型；食道移植模型有可能用于BE起源的研究[5]。

理想的GERD動(dòng)物模型應(yīng)該盡量和人類(lèi)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相似，模擬GERD的自然演變過(guò)程，且易于實(shí)踐、成活率及成功率高[7]。相對(duì)而言，目前大鼠仍是較為理想的造模動(dòng)物[45]。

目前國(guó)內(nèi)外通過(guò)結(jié)扎法，胃十二指腸吻合法、胃空腸吻合法、食管十二指腸吻合法、食管空腸吻合法、外源性食管灌注法等構(gòu)建了GERD大鼠模型，為研究GERD的病因，機(jī)制，病理變化，治療和預(yù)防提供了更多的可能。

盡管我們已經(jīng)構(gòu)建了各種大鼠反流模型，但是仍然很難將這些動(dòng)物模型的結(jié)果直接外推到人類(lèi)疾病中去。一方面要謹(jǐn)慎考慮人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物在結(jié)構(gòu)和功能上的差異，比如大鼠的胃由前胃和腺胃組成，而人的胃全是腺胃[46]；大鼠食管上皮是角化的，人的食管上皮是非角化的；大鼠食管沒(méi)有黏膜下腺體，而人類(lèi)則有[7,47]。Yano F等[47]研究表明不同國(guó)家的大鼠生長(zhǎng)曲線和飲食行為即使在同一物種中也存在顯著差異。這限制了在特定地區(qū)復(fù)制動(dòng)物模型的普遍適用性。

GERD是由多種因素引起上消化道動(dòng)力障礙性疾病，與一過(guò)性下食管括約肌松弛(transient lower esophageal sphincter relaxation,TLESR)、胃排空延遲、內(nèi)臟高敏感性、食管廓清障礙、食管黏膜屏障異常，食管裂孔疝等有關(guān)[48,49]，腦腸軸互動(dòng)異常也參與其中[50]。然而目前的GERD大鼠模型主要依靠單一的手段（手術(shù)或外源性食管灌注）來(lái)構(gòu)建[45]。它們僅符合GERD某一方面的病理生理機(jī)制，難以完全解釋人體內(nèi)多因素的相互作用[48]。大鼠術(shù)后死亡原因有梗阻（機(jī)械性腸梗阻、吻合口梗阻）、感染（腹腔感染、肺部感染）、窒息、出血、吻合口漏、和穿孔等[29,33]。上述問(wèn)題仍然有待解。

總之，我們要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目茖W(xué)地選擇造模方式來(lái)構(gòu)建盡可能理想的GERD模型，能夠把動(dòng)物研究的結(jié)果很好的外推到人類(lèi)GERD疾病研究中去。