尖孢鐮刀菌及歐文氏桿菌復(fù)合侵染引起的半夏腐爛病研究

姚天明，伏建增，南建軍，曲丹妮，田 雨，耿甜甜

（1.天水農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅 清水 741400；2.西北師范大學(xué)，甘肅 蘭州 730070）

半夏［Pinellia ternata（Thunb）Breit］以塊莖入藥，具有潤(rùn)燥化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功，為常用大宗中藥材［1］。我國(guó)年產(chǎn)干半夏約6 500 t，甘肅西和縣和清水縣是全國(guó)半夏的主要產(chǎn)區(qū)，約占總產(chǎn)的70%左右［2］。半夏塊莖腐爛病是半夏生產(chǎn)中的主要威脅，輕則減產(chǎn)10%～20%，重則絕收，主要危害維管束。在發(fā)病初期，半夏葉柄出現(xiàn)一條鐵銹色紅線，塊莖芽頭腐爛，葉脈失綠，葉片發(fā)黃，呈花葉狀，7～10 d后葉片如水燙狀，塊莖嚴(yán)重腐爛并伴有惡臭味，皮層破裂失水后呈豆腐渣樣。田間濕度大時(shí)傳播速度快，甚至整田絕收。我們對(duì)半夏腐爛病進(jìn)行了分離、提純、鏡檢、回接、藥敏及田間試驗(yàn)，以期找出行之有效的防治方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏樣本采自清水縣半夏種植基地。2019年5—8月采集健康半夏、發(fā)毛半夏（半夏塊莖表面附著灰白色鐮刀菌絲）和腐爛半夏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離提純 取供試材料用自來(lái)水沖洗24 h，70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水洗3次，再用2%次氯酸鈉浸泡2 min，無(wú)菌水洗5次，用無(wú)菌干燥濾紙吸干樣品表面水分。在超凈工作臺(tái)上用滅菌撥針挑取健康半夏芽頭內(nèi)組織塊、發(fā)毛半夏芽頭內(nèi)組織塊和腐爛半夏病健交接組織塊各5 mm×5 mm分別研磨。吸取1 mL無(wú)菌水制成菌懸液，然后分別稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液備用。PDA和NA培養(yǎng)基在121℃下滅菌30 min，不同濃度菌懸液接種后置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)48 h，選取有10～20個(gè)獨(dú)立菌落的培養(yǎng)皿，對(duì)各菌落進(jìn)行分類計(jì)數(shù)、鏡檢，最后對(duì)符合鐮刀菌和歐文氏桿菌的特征菌落進(jìn)行提純。

1.2.2 回接試驗(yàn) 回接試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為處理1，尖孢鐮刀菌；處理2，歐文氏桿菌；處理3，先接尖孢鐮刀菌，培養(yǎng)3 d后再接歐文氏桿菌；處理4（CK），加無(wú)菌水。

接種時(shí)，選取健康的直徑約1 cm的半夏塊莖，用自來(lái)水沖洗10 min，70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水充分沖洗后，每20粒置于無(wú)菌加蓋瓶底置濾紙的直徑8 cm的玻璃瓶中，然后用無(wú)菌接種針挑取提純的各處理菌落，放入加了5 mL滅菌水的試管中充分震蕩，倒入各加蓋玻璃瓶中，貼上標(biāo)簽。在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計(jì)半夏發(fā)芽率和腐爛率。

半夏塊莖腐爛病鑒定分級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)?。?級(jí)，塊莖腐爛病斑＜?jí)K莖總面1/4；2級(jí)，塊莖腐爛病斑占?jí)K莖總面1/4～1/2；3級(jí)，塊莖腐爛病斑占?jí)K莖總面1/2～3/4；4級(jí)，塊莖腐爛病斑占?jí)K莖總面3/4以上［3］。

腐爛病發(fā)病率=（腐爛病粒數(shù)/調(diào)查總粒數(shù)）×100%

病情指數(shù)=［∑（各級(jí)腐爛病粒數(shù)×該級(jí)級(jí)數(shù)）］/（調(diào)查粒數(shù)×最高級(jí)級(jí)數(shù)）

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 尖孢鐮刀菌藥敏試驗(yàn)采用絲狀真菌紙片擴(kuò)散法［4］。制作紙片所用藥劑分別為50%多菌靈可濕性粉劑、30%惡霉靈、50%代森錳鋅可濕性粉劑、50%福美雙可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、15%三唑酮可濕性粉劑、430 g/L戊唑醇懸浮劑。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)采用1997年美國(guó)NCCLS對(duì)藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)［5］。采用標(biāo)準(zhǔn)紙片和自制紙片2種，標(biāo)準(zhǔn)紙片分別為慶大霉素（GM10）、西（頭孢呋辛）、羧芐西林（CB100）、頭孢他啶（達(dá)）、哌拉西林（氧）、紅霉素（E15）、卡那霉素（K30）；自制紙片所使用的藥劑分別為80%乙蒜素1 000倍液、20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）500倍液、15%三唑酮可濕性粉劑（江西劍牌農(nóng)化股份有限公司）500倍液、6%春雷霉素細(xì)菌一遍凈可濕性粉劑（山東韓農(nóng)化學(xué)有限公司）500倍液、10%中生·氨基寡糖素（2.5%中生菌素，氨基寡糖素7.5%）500倍液、46%氫氧化銅水分散粒劑（美國(guó)杜邦公司）1 000倍液、86.2%氧化亞銅可濕性粉劑（挪威·勞道克斯公司）1 000倍液。自制紙片用不同藥劑浸濕后，置于80℃烘箱中烘干。在超凈工作臺(tái)中分別取提純的尖孢鐮刀菌、歐文氏桿菌用涂布棒涂布接種于滅菌的NA培養(yǎng)基上，然后每皿貼7種自制紙片，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后觀察抑菌環(huán)的大小，測(cè)定2種菌對(duì)不同藥劑的敏感性。

紙片擴(kuò)散法是WHO推進(jìn)使用的微生物敏感性測(cè)定方法，能在抑菌濃度范圍內(nèi)待測(cè)菌的生長(zhǎng)被抑制，形成透明的抑菌圈。根據(jù)抑菌圈的大小可判斷待測(cè)菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，一般分為敏感（S）、中介（I）和耐受（R）3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于唑類藥物抑制鐮刀菌，R≤13 mm，14 mm≤I≤16 mm，S≥17 mm；對(duì)于腸桿菌科的細(xì)菌，不同藥物敏感程度的判定略有差異，我們以最大直徑為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定測(cè)量值為R≤20 mm，21 mm≤I≤30 mm，S≥31 mm。

1.2.4 溫室盆栽試驗(yàn) 采用直徑1.0～1.5 cm健康半夏塊莖做種，用430 g/L戊唑醇1 000倍液＋80%乙蒜素1 000倍液混合液處理種莖，以未處理為對(duì)照，采用對(duì)比法排列，進(jìn)行催芽。盆長(zhǎng)0.80 m，寬0.25 m，每盆種植0.3 kg，每處理種植10盆，播種后在整個(gè)生長(zhǎng)期觀察發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 各供試材料的微生物分離結(jié)果

通過(guò)對(duì)健康半夏、發(fā)毛半夏和腐爛半夏樣本進(jìn)行微生物分離、鏡檢的結(jié)果（表1）可以看出，土壤中存在大量細(xì)菌，可腐生于半夏塊莖內(nèi)，半夏不同塊莖細(xì)菌種類有所不同，但絕大多數(shù)植物病原細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌只檢出1種，通過(guò)查閱文獻(xiàn)［6］，結(jié)合田間癥狀觀察，認(rèn)為是歐文氏桿菌。在腐爛半夏中未能檢出鐮刀菌絲，主要原因可能為腐爛半夏中存在大量歐文氏桿菌，歐文氏桿菌通過(guò)占位性競(jìng)爭(zhēng)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，抑制了尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。在發(fā)毛半夏中既檢出了尖孢鐮刀菌，又檢出了大量歐文氏桿菌，認(rèn)為由于發(fā)毛半夏尖孢鐮刀菌大量生長(zhǎng)，對(duì)半夏造成傷口，從而有利于土壤中的歐文氏桿菌的侵入，歐文氏桿菌侵入半夏后生長(zhǎng)迅速，進(jìn)而抑制了其他內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以在腐爛半夏中只檢出了歐文氏桿菌，健康半夏中檢測(cè)出尖孢鐮刀菌、放線菌、芽孢桿菌和其他革蘭氏陽(yáng)性桿菌，而很少檢出歐文氏桿菌。

表1 不同半夏樣本微生物分離主要結(jié)果

2.2 尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復(fù)合侵染回接試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，單接尖孢鐮刀菌并沒(méi)有發(fā)生腐爛病，但影響半夏的發(fā)芽率。單接歐文氏桿菌的發(fā)病率有所提高，但發(fā)芽率降低。復(fù)合接種尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌的發(fā)芽率嚴(yán)重降低，腐爛率大大增加。由此表明，半夏腐爛病的發(fā)生是由尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復(fù)合侵染形成的，其中尖孢鐮刀菌菌絲在半夏塊莖表面附著繁殖，刺傷了半夏，造成歐文氏桿菌侵染的微傷口，為歐文氏桿菌的侵染提供了條件；歐文氏桿菌在半夏塊莖內(nèi)大量繁殖，產(chǎn)生解果膠酶和解淀粉酶，使半夏塊莖分解，造成腐爛。

2.3 歐文氏桿菌和尖孢鐮刀菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（圖1、圖2、圖3）顯示，歐文氏桿菌對(duì)諾氟沙星、慶大霉素、哌拉西林和乙蒜素敏感，其中諾氟沙星、慶大霉素和哌拉西林是臨床上常用的治療腸桿菌科疾病的常用藥，而我們所得歐文氏桿菌正是腸桿菌科細(xì)菌，進(jìn)一步證明了結(jié)果的正確性。乙蒜素是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的常用藥，屬于低毒生物農(nóng)藥，可供防治半夏腐爛病選擇。其他幾種農(nóng)藥耐受性高，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇。尖孢鐮刀菌對(duì)戊唑醇敏感，對(duì)三唑酮中介，對(duì)其他如多菌靈、代森錳鋅、代森鋅、惡霉靈等耐受。半夏生產(chǎn)上建議使用三唑類藥物。

表2 尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌的復(fù)合侵染回接試驗(yàn)結(jié)果

2.4 溫室盆栽

通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)觀察，種莖用戊唑醇和乙蒜素浸種催芽的，整個(gè)生長(zhǎng)季沒(méi)有發(fā)病，而對(duì)照在5月中旬大量發(fā)病，發(fā)病率達(dá)40%以上，其中3盆絕收。

3 結(jié)論與討論

我們以家種健康半夏、發(fā)毛半夏和腐爛半夏為材料，對(duì)引起半夏腐爛病的尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌進(jìn)行分離、提純、鏡檢、回接和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果在家種健康半夏和發(fā)毛半夏中分離出尖孢鐮刀菌，在發(fā)毛半夏和腐爛半夏中分離到歐文氏桿菌。回接試驗(yàn)表明，接種尖孢鐮刀菌腐爛病發(fā)病率為0，半夏發(fā)芽率75%；接種歐文氏桿菌腐爛病發(fā)病率為20%，半夏發(fā)芽率60%；而先接種尖孢鐮刀菌，3 d后再接種歐文氏桿菌的半夏，腐爛病發(fā)病率為90%，半夏發(fā)芽率20%。藥敏試驗(yàn)和盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌對(duì)三唑類農(nóng)藥戊唑醇敏感，歐文氏桿菌對(duì)乙蒜素敏感，并具有很好的防治效果。可以得出，半夏腐爛病是由尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復(fù)合侵染引起的。

何煜波等［7］采用針刺浸泡法對(duì)半夏軟腐病病原菌進(jìn)行分離、回接以及16s DNA片段的擴(kuò)增和序列分析，認(rèn)為半夏腐爛病病原為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種；孫新榮等［8］通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和致病性測(cè)定，表明引起半夏塊莖腐爛病的病原物為尖孢鐮刀菌。我們不僅在發(fā)毛半夏中檢測(cè)出尖孢鐮刀菌，也在許多健康半夏塊莖種檢測(cè)出尖孢鐮刀菌，因此認(rèn)為尖孢鐮刀菌是半夏塊莖的內(nèi)生菌，營(yíng)弱寄生和腐生生活；在半夏生長(zhǎng)期，尖孢鐮刀菌在健康半夏維管束內(nèi)病菌擴(kuò)展是比較緩慢的，通常不發(fā)病。但由于栽培半夏播種量大，部分病籽、劣籽帶菌量大，當(dāng)溫濕度環(huán)境適宜，如土溫在10℃以上，相對(duì)濕度大于80%時(shí)菌絲大量繁殖，這些菌絲再次侵染健康半夏，對(duì)健康半夏造成微傷口，而微傷口又是歐文氏桿菌侵入的入口。歐文氏桿菌存在于土壤中，既可通過(guò)自然孔口入侵，但更主要的入侵途徑是微傷口。因此認(rèn)為半夏腐爛病由尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復(fù)合侵染所致，要對(duì)半夏腐爛病進(jìn)行有效防治，必須要同時(shí)抑制尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌。一般病害防治試驗(yàn)是直接對(duì)作物施藥，然后比較發(fā)病率和嚴(yán)重度進(jìn)行藥物有效性試驗(yàn)，我們采用醫(yī)院檢驗(yàn)科所用藥敏試驗(yàn)，對(duì)藥物的篩選具有直觀、簡(jiǎn)便和用時(shí)短的特點(diǎn)，通過(guò)藥敏試驗(yàn)，篩選出對(duì)病原菌敏感的藥劑，然后在進(jìn)行大田防治試驗(yàn)，針對(duì)性強(qiáng)，效果好，是一種值得推廣的好方法。