利用SSR標(biāo)記鑒定當(dāng)歸的真實性

劉新星，歐巧明，羅俊杰，石有太，李忠旺，崔文娟

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

當(dāng)歸是傘形科二年生或多年生草本植 物［1-4］，全世界約有80個物種，大部分產(chǎn)于北溫帶和新西蘭地區(qū)。我國有當(dāng)歸的26種5變種1變型，主要分布于我國中部、東北部和西南部地區(qū)［1］。2015版《中華人民共和國藥典》收載的當(dāng)歸來源僅為當(dāng)歸［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］的干燥根，其余品種與當(dāng)歸在功效上均有較大差異，嚴(yán)重影響用藥安全［5］。甘肅省栽培的當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸干燥根，被列為上品，為臨床常用中藥?！吨袊参镏尽分杏涊d：“當(dāng)歸主產(chǎn)甘肅東南部，以岷縣產(chǎn)量多，質(zhì)量好；其次為云南、四川、陜西、湖北等省，均有栽培。”［6］。目前，當(dāng)歸的分子鑒定主要在ITS、trnl-F、ISSR 和 RAPD上有研究［7-13］，SSR上的研究還未見到。自陳士林［14］首次提出把ITS2作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼以來，ITS2條形碼序列備受關(guān)注，已被廣泛用于多種藥用植物和藥材的鑒定，表現(xiàn)出較強的鑒定能力?？梢姡肧SR分子標(biāo)記技術(shù)同樣可獲得可用于正品當(dāng)歸鑒定的特異標(biāo)記。我們以甘肅當(dāng)歸幾大主產(chǎn)區(qū)的栽培當(dāng)歸和育成當(dāng)歸品種岷歸系列及當(dāng)歸同科不同屬藥材為研究對象，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進行當(dāng)歸的真實性鑒定，可為正品當(dāng)歸鑒定及指紋圖譜構(gòu)建提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為采自甘肅當(dāng)歸主栽區(qū)卓尼縣、岷縣、渭源縣、漳縣的23種栽培當(dāng)歸，以及采自渭源縣會川鎮(zhèn)半陰坡村種質(zhì)資源圃的當(dāng)歸品種（系）PGIJ2009-0082、岷歸1號、岷歸3號、岷歸4號、岷歸5號、岷歸6號；采自隴西藥圃園當(dāng)歸同科不同屬藥材紅柴胡、川穹、柴胡、北沙參、獨活、羌活、小防風(fēng)，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供（表1）。

1.2 采樣方法

選取甘肅當(dāng)歸主栽區(qū)卓尼縣、岷縣、渭源縣、漳縣的18個鄉(xiāng)鎮(zhèn)23個村采集栽培當(dāng)歸。以村為居群單位，居群間隔50km以上，每個居群采集5個單株（單株間相距50m左右）混樣1份。同時在渭源縣會川鎮(zhèn)半陰坡村種質(zhì)資源圃采集當(dāng)歸品種（系）PGIJ 2009-0082、岷歸1號、岷歸3號、岷歸4號、岷歸5號、岷歸6號各5個單株（單株間相距50 m左右）混樣1份；在隴西藥圃園采集當(dāng)歸同科不同屬藥材紅柴胡、川穹、柴胡、北沙參、獨活、羌活、小防風(fēng)各5個單株（單株間相距50 m左右）的混樣1份。及時摘取混合樣品的幼嫩新鮮葉片，置于盛有硅膠顆粒的密封袋內(nèi)立即干燥。

表1 供試材料的編碼及產(chǎn)地來源①

1.3 樣品處理及DNA提取

每份樣品取約50 mg，用液氮研磨，采用植物提取基因組試劑盒進行樣品DNA提取，提取完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行樣品質(zhì)量檢測，并用紫外分光光度計測定其濃度和純度。將DNA稀釋至20～50ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR引物設(shè)計、擴增和產(chǎn)物檢測

根據(jù)NCBI上公布的175條當(dāng)歸屬EST序列，利用SSR Hunter軟件搜索微衛(wèi)星，Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物22對，另搜索得到當(dāng)歸近緣屬柴胡的SSR引物53對，共計合成引物75對。其中每條引物根據(jù)其理論退火溫度（Tm）值±5℃，設(shè)置梯度溫度，找到最優(yōu)Tm值。PCR擴增體系總反應(yīng)體積15 μL， 包 括 2 ×Taq Master Mix 7.5 μL，DNase-Free Water 4.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，黨參基因組 1 μL。反應(yīng)程序：95℃熱啟動3 min，95℃變性45 s，48～65℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)后，72℃終延伸5 min后結(jié)束。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠下檢測，采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，用銀染色法進行多態(tài)性檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)采用人工讀帶的方法，將電泳圖上可重復(fù)的、易分辨的條帶記為“1”，同一位置無帶計為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用PopGen 32軟件和NTSYS軟件計算遺傳距離，UPGMA聚類進行鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性檢測

共合成引物75對，利用2個當(dāng)歸模板進行引物篩選，能夠擴增出清晰條帶的引物有21對，有效引物擴增率為28%。篩選出多態(tài)性引物5對，多態(tài)引物擴增率為6.7%。5對引物在36份當(dāng)歸及近緣物種中共檢測到41個位點，平均為8.2個；多態(tài)性位點41個，多態(tài)性比率（PPB）為 100%（表2）。5對引物的多態(tài)信息含量為0.118 7～0.310 1，平均為0.258 8。從圖1看出，多數(shù)當(dāng)歸均在約 145 bp、190 bp、220 bp、230 bp、290 bp、310 bp處有明顯條帶，而7份近緣物種中只有獨活、川芎和北沙參有1～2處當(dāng)歸相同位點，其余4個近緣物種均沒有與當(dāng)歸相同的位點，因此根據(jù)引物CH50能夠構(gòu)建當(dāng)歸指紋鑒定圖譜。

2.2 當(dāng)歸與近緣物種的遺傳距離

將29份當(dāng)歸按照產(chǎn)地劃分為4個居群，利用Popgen軟件計算當(dāng)歸居群之間及與近緣物種之間的遺傳距離和遺傳相似度。從表3可以看出，4個產(chǎn)地當(dāng)歸之間遺傳距離為0.013 4～0.091 7，遺傳相似度為0.912 3～0.986 7；與7個當(dāng)歸近緣物種間遺傳距離為0.244 1～0.941 0，遺傳相似度為0.390 2～0.783 4。當(dāng)歸與獨活的遺傳距離最近，與紅柴胡遺傳距離最遠。當(dāng)歸與近緣物種間的遺傳距離最小值明顯大于4個產(chǎn)地當(dāng)歸種內(nèi)遺傳距離最大值。因此，SSR標(biāo)記可有效鑒定當(dāng)歸及近緣物種。

表2 篩選的5對SSR引物對供試材料的檢測位點數(shù)及多態(tài)比率

表3 4種產(chǎn)地當(dāng)歸與近緣物種間的遺傳相似度（GI）和遺傳距離（GD）①

2.3 UPGMA聚類分析

從圖2看出，36份材料可以聚為兩大類，其中29份當(dāng)歸與獨活、北沙參聚為一類，其他6份近緣物種聚為一類。在閾值0.78處，可以分為8支，獨活、北沙參、川芎、羌活、小防風(fēng)單獨各自聚為1支，柴胡和紅柴胡聚為1支，當(dāng)歸5和17聚為1支，其他27份當(dāng)歸聚為1支。表明篩選出的SSR標(biāo)記能夠?qū)?dāng)歸與其近緣物種進行有效鑒別。

3 結(jié)論與討論

中藥材傳統(tǒng)的鑒定方法主要是性狀鑒定、顯微鑒定和化學(xué)特征鑒定［15］，受原植物生長環(huán)境、生長期及炮制加工工藝的影響較大。DNA分子鑒定法在作物上應(yīng)用多年，近年來在藥用植物上得到迅速發(fā)展。陳士林［14］對上千種中草藥及混偽品的DNA條形碼經(jīng)過10 a研究，創(chuàng)建了“以ITS2為主體的中草藥DNA條形碼鑒定新體系”。本研究發(fā)現(xiàn)，利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的當(dāng)歸指紋圖譜表明，來自4個產(chǎn)區(qū)的29份當(dāng)歸（包括5個當(dāng)歸品種1個品系）指紋圖譜完全一致。從聚類結(jié)果看，4個產(chǎn)地的當(dāng)歸居群之間遺傳距離僅為0.013 4～0.091 7，表明甘肅栽培當(dāng)歸種質(zhì)資源相似度極高。

甘肅是當(dāng)歸規(guī)?；N植的最大省份，其育苗及栽培管理技術(shù)相對其他藥材成熟，幾大主產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸種源來源一致性高，這可能是SSR標(biāo)記未檢測到產(chǎn)地差異的主要原因。道地藥材岷歸其品質(zhì)高于其他產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸，主要是由產(chǎn)區(qū)氣候環(huán)境和土壤多因素影響，如若進行產(chǎn)地鑒定從而構(gòu)建道地藥材的獨有標(biāo)記從生境、化學(xué)成分結(jié)合分子標(biāo)記更加可行。近年來甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育出了岷歸系列品種，其中岷歸1號、岷歸5號、岷歸6號、PGIJ2009-0082為系統(tǒng)選育的當(dāng)歸品種（系），岷歸3號和岷歸4號為重離子輻照生物育種選育的當(dāng)歸品種。目前甘肅大面積種植的當(dāng)歸品種為岷歸1號，采用人工選擇的傳統(tǒng)育種方法，在人工選育優(yōu)良品種的過程中只有每一世代里最符合需求的植株的種子才能被繼續(xù)播種，這樣的篩選導(dǎo)致了遺傳瓶頸，減少了整個基因組中的遺傳多樣性［16-17］。

本研究中，利用篩選出的SSR標(biāo)記能區(qū)分當(dāng)歸與其近緣物種。SSR標(biāo)記具有共顯性，可重復(fù)性高，多態(tài)性豐富，對DNA質(zhì)量要求低，可通過PCR快速檢測達到鑒定目的，可作為ITS2序列的補充手段。但本研究中所選的參照樣本數(shù)量較少，還需進一步擴大參試樣本量及混偽品種，反復(fù)試驗從而開發(fā)出切實可行的當(dāng)歸特異標(biāo)記，以便為快速有效地進行當(dāng)歸的真實性鑒定和遺傳多樣性分析及資源的評價利用等提供重要技術(shù)手段。

志謝：

供試材料的鑒定均在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所石有太老師的指導(dǎo)與幫助下進行。同時感謝渭源縣會川鎮(zhèn)半陰坡村種質(zhì)資源圃、隴西藥圃園在采樣過程中提供的協(xié)助。