大竹蟶消化酶活性的響應面法分析

張雨 陳愛華 吳楊平

摘要：旨在利用響應面法研究溫度、鹽度和pH值3個因素及其聯(lián)合效應對大竹蟶3種消化酶（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）活性的影響。結(jié)果表明，大竹蟶消化酶活性隨著鹽度、溫度及pH值的變化呈先增大后減小的變化規(guī)律。另外，通過Box-Behnken模型預測大竹蟶中3種消化酶活性最佳時的養(yǎng)殖條件，得出蛋白酶活性在鹽度為27.89‰、溫度為27.29 ℃、pH值為7.75時最佳，為0.479 U/mg;脂肪酶活性在鹽度為28.19‰、溫度為26.80 ℃、pH值為7.99時最佳，為0.291 U/mg;淀粉酶活性在鹽度為27.85‰、溫度為25.97 ℃、pH值為8時最佳，為0.958 U/mg?？紤]到實際養(yǎng)殖操作的便利性，將養(yǎng)殖條件調(diào)整為鹽度28‰、溫度27 ℃、pH值8，在該條件下大竹蟶的消化能力較好。

關鍵詞：大竹蟶;消化酶;響應面;養(yǎng)殖條件

中圖分類號： S968.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0166-06

收稿日期：2019-07-09

基金項目：江蘇省海洋水產(chǎn)研究所青年科學基金（編號：SQ201704）;南通市科技創(chuàng)新計劃（編號：JC2018136）。

作者簡介：張 雨（1986—），男，廣西玉林人，碩士，工程師，主要研究方向為貝類遺傳育種與增養(yǎng)殖技術。E-mail：zhangyutan610@163.com。

通信作者：陳愛華，研究員，主要研究方向為貝類遺傳育種與增養(yǎng)殖技術。E-mail：chenah540540@aliyun.com。 ?消化酶（digestive enzyme）是指由動物消化腺和消化系統(tǒng)分泌的起消化作用的酶類，主要包括糖類水解酶（淀粉酶、纖維素酶）、蛋白酶和脂肪酶，是衡量生物體生理健康狀態(tài)的重要指標[1]。消化酶不但隨動物種類、健康狀況和生長階段的不同而有所差異，還受溫度、鹽度、pH值等的諸多環(huán)境因子的影響[2]。目前，有關貝類消化酶的研究僅限于單一環(huán)境因素，如有關褶紋冠蚌（Cristaria plicata）[3]、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[3]、紫貽貝（Mytilus edulis）[4]、濱螺（Littorina littorea）[4]、櫛孔扇貝（Chlamys Farreri）[5]及鮑（Abalone）[6-7]等消化酶的研究，較少考慮環(huán)境因素的聯(lián)合作用。大竹蟶俗稱蟶子王，是廣泛分布于我沿海的貝類之一。江蘇呂四漁場內(nèi)如東、啟東一線歷來具有相當?shù)拇笾裣|資源量，但是近年來圍填海、港口建設等因素對海洋生境造成了不同程度的影響，使得大竹蟶的生理健康狀態(tài)受到了嚴重挑戰(zhàn)。因此，開展環(huán)境因素聯(lián)合作用對大竹蟶消化酶的影響研究具有重要意義。

響應面法是一種解決多變量問題的數(shù)學統(tǒng)計分析方法，主要通過提供合理的試驗設計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、評價多種變量之間的交互作用而建立數(shù)學模型和三維立體響應曲面圖形，最終得出最優(yōu)參數(shù)組合的多元回歸方程[8]。目前，響應面法在食品工藝優(yōu)化[9-11]和藥物研發(fā)[12-13]等領域有較多應用，在水產(chǎn)動物研究方面運用得較少。本研究利用響應面法研究溫度、鹽度和pH值3個因素及其聯(lián)合效應對大竹蟶消化酶活性的影響，并利用多元回歸方程模擬出大竹蟶消化酶活性最高時的養(yǎng)殖條件，以期為大竹蟶養(yǎng)殖條件優(yōu)化、人工苗種繁育和增殖放流提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用大竹蟶取自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所文蛤良種場，選取相同規(guī)格、健康無損的大竹蟶作為試驗用貝，在聚乙烯水槽中暫養(yǎng)7 d后，投喂105 inds/mL的球等鞭金藻（Isochrysis galbana）并每天換1次水，試驗開始前停喂1 d。

1.2 試驗方法

試驗采用Box-Behnken模型設計，根據(jù)預試驗結(jié)果，設計3因素3水平試驗，試驗設計及其結(jié)果見表1。本試驗所用鹽度、溫度及pH值均設3個梯度，其中鹽度分別設為22‰、28‰、34‰，溫度分別設為20、27、34 ℃，pH值分別設為6.5、8.0、9.5。海水鹽度通過海水、海水晶及淡水配制得到;溫度通過加熱板進行調(diào)節(jié);pH值通過1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)至本試驗所需值。試驗在17個聚乙烯水槽中進行，每個水槽中放置20個大竹蟶，在試驗過程中應及時挑出死亡個體，脅迫3 d后任取3個大竹蟶進行解剖，取肝胰臟組織，用于消化酶[蛋白酶（PRS）、脂肪酶（LPS）和淀粉酶（AMS）]活性的測定。

蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性及總蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定并按說明書上的公式計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Design-Expert 8.0軟件進行試驗設計和數(shù)據(jù)分析，以鹽度（A）、溫度（B）、pH值（C）為自變量，分別以蛋白酶活性、脂肪酶活性、淀粉酶活性為因變量建立模型方程，并對3種消化酶活性的最大值進行預測和條件優(yōu)化?；貧w擬合大竹蟶消化酶模型曲線并用Origin 8.0軟件作相應的3D響應面圖。消化酶活性（y）的模型方程如下：

y=k+x1A+x2B+x3C+x4AB+x5AC+x6BC+x7A2+x8B2+x9C2+ε。

式中：k為截距;x1、x2、x3分別為鹽度與溫度、鹽度與pH值、溫度與pH值的一次效應;x4、x5、x6分別為鹽度與溫度、鹽度與pH值、溫度與pH值之間的交互作用;x7、x8、x9分別為鹽度、溫度、pH值之間的二次效應;ε為殘差，假定其服從均值為0的正態(tài)分布。

通過方差分析（analysis of variance，簡稱ANOVA）確定回歸方程模型及各試驗因素的顯著性，給出決定系數(shù)以考察模型的擬合優(yōu)度，模型中各項效應采用最小二乘法進行估計。采用F統(tǒng)計量進行顯著性檢驗，當P<0.05時，表示差異顯著;當P<0.01時，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活性模型分析及響應面分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合。如表3所示，F(xiàn)值為53.52，P<0.000 1，模型R2為0.980 7，修正系數(shù)為 0.967 3，表明該模型的擬合度較好，預測值與試驗值高度吻合，因此可用該模型來分析并預測大竹蟶蛋白酶活性。本試驗的精確度（Adeq precision）為19.917%，說明本試驗結(jié)果可信。另外，本試驗結(jié)果顯示，鹽度、溫度對大竹蟶蛋白酶活性的一次效應影響不顯著;pH值對大竹蟶蛋白酶活性的一次效應影響極顯著（P<0.01）;鹽度、溫度交互作用對大竹蟶蛋白酶活性的影響顯著（P<0.05），鹽度和pH值、溫度和pH值交互作用對大竹蟶蛋白酶活性的影響不顯著;鹽度、溫度和pH值的二次效應對大竹蟶蛋白酶活性的影響極顯著（P<0.01）。由上述回

根據(jù)上述結(jié)果，用Origin 8.0作出3D響應面圖。如圖1所示，當保持溫度、鹽度、pH值3個因子中的1個為中值時，隨著其他2個因子數(shù)值的升高，大竹蟶體內(nèi)蛋白酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;各響應曲面圖均顯示，在本試驗設置的溫度、鹽度、pH值范圍內(nèi)存在蛋白酶活性的最大值。根據(jù)上述模型結(jié)果優(yōu)化出蛋白酶活性最大時的養(yǎng)殖條件如下：鹽度為27.89‰，溫度為27.29 ℃，pH值為775，此時的PRS活性為0.479 U/mg。

2.2 脂肪酶活型模型的分析及響應面分析

用Design-Expert 8.0軟件對表2中的脂肪酶活性進行二次多元回歸擬合。如表4所示，F(xiàn)值為5.43，P<0.05，模型的R2為0.874 7，修正系數(shù)為0713 5，表明該模型的擬合度較好，預測值與試驗值高度吻合，因此可以用該模型來分析并預測大竹蟶的脂肪酶活性。本試驗的精確度為6.319%，說明本試驗結(jié)果較為可信。另外，本試驗結(jié)果顯示，鹽度、溫度和pH值的一次效應及交互效應對大竹蟶脂肪酶活性的影響不顯著;溫度、鹽度的二次效

應對大竹蟶脂肪酶活性的影響顯著（P<0.05），pH值的二次效應對大竹蟶脂肪酶活性的影響極顯著（P<0.01）。由上述回歸結(jié)果擬合出的鹽度（A）、溫度（B）和pH值（C）與脂肪酶活性的編碼值回歸方程如下：

根據(jù)上述結(jié)果，用Origin 8.0作出3D響應面圖。如圖2所示，當保持溫度、鹽度、pH值3個因子中的1個為中值時，隨著其他2個因子數(shù)值的升高，大竹蟶體內(nèi)的脂肪酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的

趨勢;各響應曲面圖均顯示，在本試驗設置的溫度、鹽度、pH值范圍內(nèi)存在脂肪酶活性的最大值。根據(jù)上述模型結(jié)果優(yōu)化出脂肪酶活性最大時的養(yǎng)殖條件如下：鹽度為28.19‰，溫度為26.80 ℃，pH值為7.99，此時的LPS活性為0.291 U/mg。

2.3 淀粉酶活性模型分析及響應面分析

用Design-Expert 8.0軟件對表2中的淀粉酶活性進行二次多元回歸擬合。如表5所示，F(xiàn)值為20.41，P<0.01，模型的R2為0.963 3，修正系數(shù)為0.916 1，表明該模型的擬合度較好，預測值與試驗值高度吻合，因此可以用該模型來分析和預測大竹蟶淀粉酶活性。本試驗的精確度為12002%，說明本試驗結(jié)果可信。另外，本試驗結(jié)果顯示，鹽度和pH值對大竹蟶淀粉酶活性的一次效應影響不顯著，溫度對大竹蟶淀粉酶活性的一次效應影響顯著（P<0.05）;鹽度、溫度和pH值交互作用對大竹蟶淀粉酶活性的影響不顯著;鹽度、溫度和pH值的二次效應對大竹蟶淀粉酶活性的影響極顯著（P<001）。由上述回歸結(jié)果擬合的鹽度（A）、溫度（B）和pH值（C）與淀粉酶活性的編碼值回歸方程如下：

根據(jù)上述結(jié)果，用Origin 8.0作出3D響應面圖。由圖3可見，當保持溫度、鹽度、pH值3個因子中的1個為中值時，隨著其他2個因子數(shù)值的升高，大竹蟶體內(nèi)的淀粉酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，各響應曲面圖均顯示，在本試驗設置的溫度、鹽度、pH值范圍內(nèi)存在淀粉酶活性的最大值。根據(jù)上述模型結(jié)果優(yōu)化出淀粉酶活性最大時的養(yǎng)殖條件如下：鹽度為2785‰，溫度為25.97 ℃，pH值為8，此時的AMS活性為0.958 U/mg。

3 討論

鹽度、溫度及pH值均是影響濾食性貝類消化酶活性的關鍵因素[1]。貝類是變滲透壓動物，當海水鹽度過高或過低時，貝類機體會主動排除水分或鹽分以適應環(huán)境[14]。在調(diào)節(jié)滲透壓的過程中，貝類會消耗大量能量，消化能力相應減小。本試驗結(jié)果顯示，大竹蟶消化酶活性在鹽度為28‰左右時較大。鹽度過高或過低，消化酶活性均有所降低，符合上述規(guī)律。酶促反應動力學認為，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶促反應的速度也加快，超出一定溫度后便開始下降。本試驗結(jié)果表明，當溫度約為27 ℃時，消化酶活性達到較大值，符合上述規(guī)律。pH值可以通過影響底物的解離狀況、酶分子活性部位上有關基團的解離、中間絡合物（ES）的解

離狀態(tài)來影響酶活性[15]。本試驗結(jié)果表明，大竹蟶在pH值約為8時，其消化酶活性達到較大值，可作為養(yǎng)殖的最佳參考條件。

不同貝類體內(nèi)的消化酶活性與其食性有關，喜食大型藻的貝類一般其纖維素酶活性相對較高，如濱螺等腹足綱貝類;而食單細胞藻類的貝類淀粉酶、蛋白酶活性相對較高，如紫貽貝等雙殼貝類[4]。在本試驗中，投喂大竹蟶的餌料為球等鞭金藻，沒有纖維素構成的細胞壁，鑒于食性對貝類消化酶種類的影響，本試驗僅測定大竹蟶3種功能消化酶（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）活性而未考察纖維素酶活性。本研究結(jié)果顯示， 大竹蟶體內(nèi)消化酶活性排序淀粉酶>蛋白酶>脂肪酶， 這與馬氏珠母貝的研究結(jié)果[16]相似。

目前針對貝類消化酶的研究較少考察環(huán)境因素的聯(lián)合作用及曲面效應。本試驗構建的Box-Behnken模型擬合度很高，說明該模型能夠很好地解釋大竹蟶消化酶隨環(huán)境因素的變化。本試驗得出大竹蟶消化酶活性最佳時的養(yǎng)殖條件如下：鹽度為28‰左右，溫度為27 ℃左右，pH值約為8，該條件可用于實際生產(chǎn)。

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