植物內生真菌產多糖類天然產物研究進展

潘峰 侯凱 劉云 吳衛(wèi)

（1. 遵義醫(yī)科大學 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，遵義563000；2. 四川農業(yè)大學農學院，成都 611130）

多糖（Polysaccharide）是一類由10個以上單糖分子脫水聚合，以糖苷鍵連接，可形成直鏈或有分支的長鏈，水解后得到相應的單糖和寡糖的大分子化合物。雖然多糖種類豐富，結構多樣，也是除核酸、蛋白質之外的另一類重要的生物大分子，但對多糖的研究遠滯后于核酸和蛋白質，最主要原因是多糖本身的復雜性。與核酸、蛋白質相比，組成多糖的單糖有更多活性基團和手性原子，單糖間有多種連接方式，可形成直鏈或分支，還有多種異構體、衍生物等，使多糖具有豐富的多樣性，大部分多糖具有復雜的結構。而且，多糖鏈有較高柔韌性和親水性，易受環(huán)境影響發(fā)生空間構象變化，在復雜的一級結構基礎上，存在大量的分子間作用。結構的多樣性使天然多糖具有諸多的生物活性，并廣泛參與細胞識別、細胞生長、組織分化、新陳代謝、胚胎發(fā)育等生命過程［1］。自從20世紀50年代發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有抗癌作用以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多糖類化合物具有免疫調節(jié)、抗突變、降血脂、降血糖、抗病毒、抗凝血、抗?jié)兒涂寡趸壬锘钚裕?］。

植物內生真菌（Endophytic fungi）是指在其全部或部分生活史中存活于健康植物組織內，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的一類真菌［3］。通常，根據(jù)在細胞內外不同存在形式可分為:分泌到培養(yǎng)基的胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS），黏附在細胞壁表面的胞壁多糖和在細胞內的胞內多糖。目前，內生真菌和糖生物學是兩個研究熱點，內生真菌多糖（The polysaccharide from endophytic fungi，PSEF）作為二者的交叉內容也越來越受到人們的關注，相關報道也越來越多。已有研究表明PSEF具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗癌等功能［4-6］。加強PSEF研究不僅可獲得更多具有新型結構和廣泛活性的天然多糖產物，也能夠幫助人們更深入理解內生真菌與其宿主間的關系和相互作用機理，從而在一定程度上改善植物生長。

據(jù)不完全統(tǒng)計,內生真菌均可產生多糖，但種類、產量和活性等差異較大，內生真菌多糖生物合成具有明顯菌株差異性［7］。選擇產量高，活性好的菌株是研究PSEF的第一步。PSEF多是水溶性的EPS，故對內生真菌水提物重量和活性測定，可初步了解多糖的產量和活性。但要獲取多糖的結構信息，必須純化后才可進一步研究。目前，人們可從內生真菌的發(fā)酵液、菌絲體等獲得多種多糖成分（表1）。這也表明內生真菌可產生種類多樣具有一定生物活性的多糖成分。

1 產多糖內生真菌培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基成分，如碳源、氮源、無機離子、氧含量等都會明顯影響PSEF產生。在確定發(fā)酵菌株后，配制合適的培養(yǎng)基對內生真菌生長和代謝產物的合成非常重要。

碳源（Carbonsource）是微生物營養(yǎng)所需碳元素（碳架）的營養(yǎng)源［27，31］。其來源廣泛，但不同微生物利用碳源具有偏好性。其中，利用最廣泛的是糖類；其次是醇類、有機酸類和脂類。在糖類中，單糖勝于雙糖和多糖；已糖勝于戊糖；葡萄糖、果糖勝于甘露糖、半乳糖。在多糖中，淀粉優(yōu)于纖維素或幾丁質等純多糖；純多糖則優(yōu)于瓊脂等雜多糖和其它聚合物（如木質素）。目前，內生真菌所選用的發(fā)酵培養(yǎng)基多為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDB）培養(yǎng)基，其中主要碳源為土豆淀粉，不僅價格便宜，而且淀粉含量高。除淀粉外，一般會添加適量單糖或寡糖作為補充。如Subhadip等［32］通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、棉子糖中，當添加鼠李糖時，最有利于菌絲生長，添加葡萄糖時最有利于EPS的產生。此外，Wang等［33］研究發(fā)現(xiàn)通過添加甘油或粗甘油可促進內生真菌Chaetomium globosumCGMCC 6882多糖生產能力，其中甘油可能就是作為一種碳源物質影響其產多糖能力。

氮源（Nitrogensource）是微生物生長繁殖所需氮元素的營養(yǎng)源［27］。在真菌合成蛋白質、核酸、生物堿等代謝產物，以及調節(jié)酶活性等生化反應中具有不可替代的作用。與碳源相似，真菌能利用的氮源種類即氮源譜也十分廣泛。一般來說，內生真菌等異養(yǎng)微生物對氮源利用的順序是:“N·C·H·O”或“N·C·H·O·X”類有機氮源（如酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、尿素、甘氨酸和NH4NO3）優(yōu)于“N·H”類無機氮源（如NH4Cl），更優(yōu)于“N·O”或“N·O·X”類（如NaNO3、NO2），而最不易被利用的則是“N”類（如N3）。酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等有機氮源也是內生真菌培養(yǎng)基中主要添加的氮源［8，18，27］?？梢姡袡C氮源比無機氮源更適合內生真菌生產多糖。這可能是有機氮源能夠提供豐富的易分解的蛋白質、氨基酸和維生素等物質，滿足內生真菌在不同生長發(fā)育時期對氮源的需求。

無機鹽離子對內生真菌的生長和代謝產物的形成也必不可少。Subhadip等［32］研究不同種類的無機 鹽（HgCl2、MnCl2、FeCl3、KCl、BaCl2、NaCl、CaCl2、MgCl2）對內生真菌Fusarium solaniSD5 菌絲體生物量和EPS產量的影響發(fā)現(xiàn)，HgCl2和FeCl3顯著抑制菌絲的生長和EPS的產生，KCl、CaCl2、MgCl2和NaCl都可促進菌絲量和EPS量的增加，其中KCl效果最好?？梢?，Hg2+和Fe3+對此內生真菌具有毒性，而且Hg2+可用于內生真菌的分離過程中的植物樣品表面消毒。K+、Ga2+、Mg2+和Na+等離子通常參與調節(jié)細胞中一些酶的活性，調節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，調節(jié)pH和氧化還原電位等。此外，當在F. solaniSD5的培養(yǎng)基中添加KH2PO4（0.05 g/L）時，EPS也會明顯增加［32］。這可能是磷酸鹽參與EPS合成關鍵酶的磷酸化和去磷酸化或者在可控制物質的膜轉運proton-ATPase發(fā)揮作用。

表1 不同植物內生真菌菌株產多糖

培養(yǎng)基的pH值也會影響PSEF的產生。例如，Pestalotiopsissp. BC55在培養(yǎng)基初始pH值從4-8的變化中，其EPS產量呈現(xiàn)先增加，后降低的規(guī)律，在pH為4時最小，在pH為7時最大，其生物量和EPS產量分別增加了3.5倍和6.9倍，隨后通過響應面法分析，其最佳pH值為6.93［26］。對初始pH值的優(yōu)化結果表明，內生真菌產EPS的最佳培養(yǎng)基初始pH值在5-7之間，過酸或過堿的環(huán)境都不利于PSEF的產生。

氧氣也參與到內生真菌發(fā)酵代謝過程中。培養(yǎng)基中合適的氧含量對內生真菌正常生長，代謝產物的合成、運輸和分泌等都有影響。目前除專業(yè)的發(fā)酵罐可直接控制培養(yǎng)基中氧氣含量外，在普通搖瓶中較難實現(xiàn)精準控制，但通過控制搖瓶中培養(yǎng)基體積和轉速可間接控制培養(yǎng)基與空氣接觸面積，從而影響氧氣進入培養(yǎng)基的含量。例如，對內生真菌Pestalotiopsissp. BC55的研究發(fā)現(xiàn)，當向320 mL的發(fā)酵瓶中添加75 mL培養(yǎng)基時，其菌絲生物量和EPS產量均達到最高，分別較最低值提高了1.3倍和 13.2 倍［26］。

發(fā)酵時間和培養(yǎng)溫度對PSEF產生有顯著影響。內生真菌菌絲生長和多糖等代謝物的產生等生理生化過程均需在一定時間完成。不同培養(yǎng)時間，對PSEF產量、水提物中多糖含量、蛋白質含量、多糖類型和多糖生物活性均有不同影響。例如，分離自胡椒健康葉片中的內生真菌Diaporthesp. JF766998在培養(yǎng)了72、96和168 h后，其粗多糖產量分別為3.0、15.4和14.8 mg/100 mL發(fā)酵液；而且隨著時間增加，總多糖含量從71%增加到99.8%，蛋白質含量也從28.5%下降到0%；對于單糖組成，在培養(yǎng)72 h時，葡萄糖占84%，隨著時間增加，其下降到30%，而半乳糖和甘露糖的含量明顯增加［34］。一般發(fā)酵時間在4-30 d之間。通常，為提高發(fā)酵效率，降低發(fā)酵時間，先通過小規(guī)模發(fā)酵，在真菌生長對數(shù)期轉接到大規(guī)模發(fā)酵瓶中，此時，內生真菌生長活力較強，繁殖迅速，可縮短后期發(fā)酵所需時間。培養(yǎng)溫度可通過影響酶活性，改變內生真菌代謝速率，甚至導致某些代謝過程出現(xiàn)或終止，影響多糖產生，所以合適的培養(yǎng)溫度非常重要。由表1可見，盡管不同內生真菌發(fā)酵溫度略有不同，但是大多數(shù)基本處于20-28℃之間，溫度過低或者過高均不利于內生真菌的生長和多糖積累［26］。

總之，影響內生真菌生長和PSEF產量的因素存在差異，不同內生真菌受不同因素影響大小有所區(qū)別。例如，對內生真菌Berkleasmiumsp. Dzf12 EPS培養(yǎng)基研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、蛋白胨和MgSO4·7H2O濃度是影響EPS產生的關鍵因子［35］。對內生真菌F.solaniSD5發(fā)酵條件優(yōu)化試驗表明葡萄糖濃度（g%）、酵母抽提物濃度（g%）、培養(yǎng)基pH值和發(fā)酵天數(shù)是影響EPS產生的顯著因素（P＜0.05）［32］。目前，為得到最佳培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件，主要通過響應面分析（Response surface methodology，RSM）來完成，即先通過單因素試驗及部分因子設計（Fractional factorial design，F(xiàn)FD）找出最主要的影響因素和其影響范圍，然后利用最陡上升法、最陡下降法和中心組合（Box-Behnken design，BBD）試驗設計或者中心合成設計（Central composite design，CCD）來獲取最佳培養(yǎng)基配比和發(fā)酵條件［11，26，32，35］。

2 內生真菌多糖的提取、分離和純化

2.1 內生真菌多糖的提取

目前，內生真菌多糖的提取根據(jù)提取部位的不同存在一定差異。主要涉及胞外多糖、細胞壁和細胞內多糖，其中細胞壁和細胞內多糖可以通過配置不同酸堿度的水溶液，從細胞壁上提取不同類型的多糖。

對于胞外多糖，首先得通過離心或過濾將發(fā)酵液和菌絲分開，菌絲用蒸餾水進行沖洗，以清除菌絲中的EPS［11，32］。為減少乙醇用量，發(fā)酵液需減壓蒸發(fā)濃縮［32］，隨后利用乙醇或異丙醇進行沉淀，且在 4℃環(huán)境中靜置 12-24 h［8，26，32］，也可通過離心代替靜置，使沉淀快速分層［8］。

對細胞壁和細胞內多糖，提取方法相對劇烈。首先菌絲干燥后粉碎，有機試劑脫脂，隨后依據(jù)試驗設計配制不同pH的水溶液進行水提醇沉。如果需要同時提取菌絲水提多糖（Water-extracted mycelial polysaccharide，WPS），堿水提多糖（Sodium hydro-xide-extracted mycelial polysaccharide，SPS）和酸水提多糖（Hydrochloric-extracted mycelia polysaccharide，APS），通常以純水（pH約為7）為第一步，隨后再采用堿水（NaOH配置）或者酸水（HCl配置）進行提取，且二者順序可變。但是需要注意的是純水提取多糖，溫度可高達100℃，而堿水或者酸水均易導致糖鏈水解，在采用堿或者酸水進行提取時，溫度不宜太高，根據(jù)本課題組的經驗及相關文獻參考，建議不要超過30℃。如Zhong等［36］對一株內生真菌F. oxysporumFat9的菌絲多糖進行提取時，預處理后加入20倍體積水，在90℃下浸提約90 min，離心收集上清液，采用醇沉即得水提多糖；殘渣再用1 mol/L NaOH溶液在室溫條件下提取24 h，離心取上清液進行醇沉得堿提多糖；最后在用1 mol/L HCl在室溫條件下提取24 h，得酸提多糖，且3種多糖提取重量相近，均為7 g 左右。

由于內生真菌菌絲多糖存在差異，在料液比、提取溫度、提取時間、酸堿度、提取次數(shù)上會有不同，為了提高提取效率，可采用單因素和響應面法進行優(yōu)化。例如，內生真菌CSL-27的菌絲多糖提取過程中，通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)4個關鍵影響因子，其影響大小順序為液料比＞最終pH＞醇沉時間＞醇沉溫度，最后通過響應面優(yōu)化，確定最佳醇沉時間為16 h，醇沉溫度為37℃，pH為7.2，液料比為5∶1（L/L）［15］。利用響應面法對內生真菌F. oxysporumDzf17菌絲多糖WPS進行提取條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，提取時間為1.7 h，提取溫度為95℃，料液比為 39∶1（V/W），重復提取一次的情況下，最終提取效率較之前提高 2 倍［37］。

2.2 內生真菌多糖的分離純化

內生真菌多糖的分離純化主要包含兩部分，第一是除去多糖中色素、蛋白質、小分子物質等雜質；第二是利用分級醇沉、離子交換色譜或凝膠色譜進行分離。通常，除蛋白質的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、鹽酸脫蛋白法、三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA法）、酶法和等電點法等。除色素的方法包括活性炭吸附色素、H2O2氧化除色素、DEAE-纖維素法脫色素、堿性離子交換樹脂脫色素、膜分離技術（Membrane separation technipue，MST）和大孔吸附樹脂除色素。除去小分子物質通常用半透膜透析法或纖維濾器透析法。除去淀粉常用淀粉酶法。為提高效率，PSEF可用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶結合Sevag法除去蛋白［22］，用活性炭吸附、雙氧水氧化或大孔吸附樹脂除色素［6，23］，半透膜除小分子物質［22］。其中，利用大孔吸附樹脂可同時除色素和除蛋白，而且其條件溫和、效率較高、操作相對簡單，受到越來越多的歡迎［38］。在多糖分離步驟中，離子交換色譜和凝膠色譜仍是最常用的多糖分離純化方法，對收集到的餾分利用苯酚-硫酸法進行檢視，以餾分管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線，并根據(jù)曲線合并相同多糖，并且根據(jù)多糖峰形可初步判斷均一性［39］，也可利用高效液相凝膠柱色譜檢查多糖的均一性。

3 內生真菌多糖的結構特征研究

多糖由單糖組成，以糖苷鍵相連，形成線形或分支鏈狀大分子。通常研究多糖結構主要涉及其一級結構，包含糖苷鍵的組成、單糖殘基排列順序、相鄰單糖殘基連接方式、異頭碳構型、分支狀態(tài)、有無蛋白質或磷脂等結合物等。由于單糖種類較多，單糖殘基間存在多種連接方式，加上多糖鏈長度、支鏈等不同，造成多糖種類非常豐富，也導致多糖結構解析相較于小分子化合物而言困難更大。大部分文獻僅對所得多糖的部分理化性質，結構特征進行研究。如分離自內生真菌C. globosumCGMCC 6882的多糖 GCP 由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成，結構復雜，目前僅表征了其部分理化性質［40］。對于一些應用較廣、結構相對簡單的多糖也能解析出其多糖鏈中的主要重復單元。例如，胡椒內生真菌Diaporthesp.產多糖EPS-PD1主要由葡萄組成，經過一系列波譜和化學分析，得出其為以（1→3）鍵連接的吡喃葡萄糖為主鏈，在O-6處被葡糖基取代的重復結構單元組成的多糖［16］。目前，多糖結構描述主要涉及多糖的表觀特征、多糖平均分子量、單糖組成、單糖連接類型、單糖或者糖苷鍵的構型、重復單元等方面。

3.1 紫外光譜（Ultraviolet spectrum，UV）和掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）分析

分離純化后所得的均一多糖可利用紫外分光光度計200-400 nm紫外區(qū)間的吸光譜，觀察260和280 nm的波長處是否存在吸收峰，有則說明樣品內存在核酸或者蛋白等成分，沒有則表示多糖中無此類雜質。多糖屬于大分子成分，不同多糖鏈所表現(xiàn)出的形態(tài)結構具有一定的特征，可利用電子顯微鏡對多糖表明進行觀察。例如，本課題組對瓦布貝母內生真菌多糖進行SEM分析，發(fā)現(xiàn)不同多糖表明特征存在顯著差異［19］。

3.2 多糖平均分子量（Relative average molecular weight，RMw）分析

均一多糖為多糖分子量在一定范圍，多糖鏈重復單元一致的混合糖鏈，表示相似鏈長的平均分布。利用高效液相凝膠柱色譜或者普通的凝膠柱色譜對均一多糖分子量進行分析時，所得到的分子量為其平均分子量的一個推算值。通常用多分散性（Mw/Mn）來評價多糖分子量分布的范圍。例如，分離自內生真菌Chaetomiumsp. JY25的均一多糖通過凝膠滲透色譜法測得其平均分子量為1.961×104g/mol，多分散性值為1.838［14］。目前，常見多糖相對分子質量測定方法有光散射法、超速離心沉降速度法、氣相滲透法、端基分析法、凝膠滲透色譜法和膜滲透法。其中高效凝膠滲透色譜法由于操作方便、無需有機溶劑、時間短、分離效果好等優(yōu)勢常被用作大分子多糖的分析，是目前最常用的一種相對分子量分析方法。其次是利用常壓的凝膠色譜對多糖進行洗脫，根據(jù)洗脫曲線進行相對分子量分析。以上兩種凝膠法均根據(jù)在相同體系條件下不同標準葡聚糖的分子量和保留時間之間的線性關系推算出未知樣品的平均分子量。

3.3 單糖組成分析

單糖種類、摩爾比等是研究多糖結構信息的關鍵步驟。由于多糖以單糖殘基連成長鏈，為分析單糖，首先需對長鏈進行水解。水解法包括完全酸水解法、部分酸水解法等。完全酸水解法:將多糖與強酸（硫酸、三氟乙酸）等試劑作用，在一定溫度下（80-100℃）將所有糖苷鍵等完全水解（4-10 h）。部分酸水解法:根據(jù)不同糖苷鍵穩(wěn)定不同，利用弱酸或低濃度的強酸在相對較溫和的條件下將較易斷裂的糖苷鍵進行水解，然后利用柱色譜或分級沉淀等方法將水解后的多糖鏈分開，由于側鏈與主鏈相連的糖苷鍵較易斷裂，多糖部分酸水解后的醇析產物往往是多糖主鏈重復性結構片段、糖醛酸鏈片段，從這些小片段可推測多糖鏈部分結構特點。水解后的多糖經中和、過濾，可采用紙層析（Paper chromatography，PC）、薄層色譜（Thin layer chromatography，TLC）、氣相色譜（Gas chromatography，GC）、高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢（high performance anionexchange chromatography with pulsed ampero-metric detection，HPAEC-PAD）［8，14，18，26］等進行分析。本課題組曾利用TLC法對川貝母內生真菌Fusariumsp. A14 的胞外多糖A14EPS-1的主鏈和側鏈的單糖組成進行了分析［22］，但是該法不能定量，無法得知相關單糖間的摩爾比例。GC法和HPLC法是目前比較常見的用于多糖的單糖組分分析的方法，均可實現(xiàn)定量分析，但是均需進行衍生化。例如，本課題組對瓦布貝母內生真菌6WBY3的胞外多糖6WBY3EPS-3 和 6WBY3EPS-4的單糖組分進行分析時，首先利用PMP（l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone）進行衍生化，然后利用HPLC對衍生化產物進行分析，均獲得了其單糖組成和不同單糖間的摩爾比［19］，但是如果用質譜（Mass spectrometry，MS）檢測器，示差檢測器或者蒸發(fā)光檢測器不用考慮衍生化的問題。Orlandelli等［34］利用HPAEC-PAD法，以CarboPac PA1柱（4×250 mm）為分析柱，以0.014 mol/L NaOH溶液流動相，對內生真菌Diaporthesp.JF766998胞外多糖的單糖組分進行了分析，獲得了單糖組分及摩爾比。HPAEC-PAD法無需對樣品進行衍生化處理，流動相無需使用有機試劑，但是該法中使用了鹽溶液，不可與質譜等檢測器聯(lián)合使用。最后根據(jù)樣品峰面積和單糖標準品的濃度和峰面積可計算求得單糖間摩爾比。

3.4 單糖結構特征分析

通常，Smith降解、高碘酸氧化、甲基化反應可分析多糖鏈中糖苷鍵連接位置。其中甲基化反應應用較多，它不僅可獲得多糖中單糖連接位點，還可根據(jù)不同甲基化單糖的比例，推測這種連接鍵型在多糖重復單元中所占比例。例如，對植物內生真菌F.solaniSD5胞外均一多糖PS-1的甲基化分析得出該多糖具有L-鼠李糖基末端，（1→2）-L-鼠李吡喃糖基，（1→4）-D-鼠李吡喃糖基，（1→4，6）-D-鼠李吡喃糖基，其摩爾比接近1∶1∶3∶1［41］。

紅外光譜是定性鑒定多糖結構的基本方法，由于靈敏度較高、所需多糖樣品量少、操作簡單，已經成為最常用的多糖結構特征分析方法之一?？赏ㄟ^紅外區(qū)的特征吸收來鑒定多糖，如在3 600-3 200、3 000-2 800、1 700-1 500、1 400-1 200 和1 200-1 000 cm-1范圍內的吸收峰是多糖的特征吸收峰［42］；也可用于分析確定多糖中吡喃糖的糖苷鍵構型，如對于葡聚糖來說，840 cm-1是α-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰，890 cm-1是β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰；而810和870 cm-1是甘露糖的特征吸收峰。

3.5 核磁（Nuclear magnetic resonance，NMR）分析

NMR是解析化合物結構最有效的手段，但多糖結構的復雜性使其在這一領域的應用相對落后，近年來NMR技術有了較大發(fā)展后才得以提升。該技術可提供多糖的單糖組成、單糖殘基間的順序、單糖殘基糖苷鍵的位置和糖苷鍵的構型等諸多信息，成為當今分析多糖結構不可缺少的方法。然而，由于多糖結構自身的復雜性，許多多糖NMR信號相互重合，使得NMR的解析十分困難。對于一些由簡單的重復單元組成的多糖，利用NMR技術已可做到迎刃而解。多糖在1H-NMR譜圖上的信號多集中在δ3.5-5.5 ppm范圍內，H2-H6的質子信號在δ3.5-4.5 ppm范圍內，但疊加嚴重無法分辨，因此對于大多數(shù)多糖而言，1H-NMR的主要用途在于δ4.8-5.5 ppm范圍內異頭質子信號的解析及歸屬。一般情況下，α-構型糖基異頭質子的化學位移值超過5.0 ppm，而β-型糖基異頭質子的信號小于5.0 ppm，憑此可將二者區(qū)分開。借助于異頭質子在NMR上的峰面積之比可大體推測各種連接方式糖基在多糖中的摩爾比。此外，通過13C NMR和2D NMR可對多糖的一些重復單元的結構進行解析。常見的二維譜有COSY、HSQC、HMBC、NOESY、TOCSY等。COSY主要分析氫氫近程相關，HSQC主要分析碳氫直接相關，HMBC主要分析碳氫遠程相關，NOESY主要分析氫氫空間相關，TOCSY主要分析氫氫全相關。例如，Zeng等［43］對內生真菌F.solaniDO7多糖DY1和 DY2進行NMR分析，并結合甲基化等結果，推導出 DY1中的糖苷鍵主要包括（1 →）-α-D-Glcp，（1 → 3）-β-L-Rhaf，（1 → 4）-β-DXylp，（1 → 6）-α-D-Glcp，（1 → 2，6）-α-D-Glcp和（1→2）-β-D-Galp；而DY2中的糖苷鍵主要是（1 →）-β-D-Glcp，（1 → 2）-α-L-Rhaf，（1 → 3）-α-LAraf，（1 → 4）-β-D-Glcp，（1 → 4，6）-β-D-Glcp 和（1 → 3）-α-D-Galp。

4 內生真菌多糖的體外活性研究

4.1 抗腫瘤

腫瘤作為人類健康的一大殺手，利用PSEF來抑制腫瘤的研究相對于其它來源多糖而言較少，但從已有的報道中仍可以發(fā)現(xiàn)PSEF對腫瘤細胞具有較好的生長抑制作用，是值得進一步關注的大分子天然產物。Li等［11］對從番石榴的內生真菌Bionectria ochroleucaM21中分到的EPS進行了抗腫瘤活性測定，發(fā)現(xiàn)該EPS在濃度為0.025-1.6 mg/mL的范圍內對人體肝癌HL-7702細胞系沒有抑制活性，但是在0.1-0.45 mg/mL的濃度范圍內，對肝癌HepG2細胞系，胃癌SGC-7901細胞系和結腸癌HT29細胞系有良好的抑制活性，并且隨濃度和處理時間的增加抑制活性增強。Wen等［44］對從藏紅花中分離到的內生真菌Penicillium citreonigrumCSL-27的粗EPS的抗腫瘤活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)它對K562、A549、HL-60和HeLa細胞系均有良好的抑制增殖活性，而且具有明顯的劑量依賴，在濃度為10 mg/mL時，該多糖對K562、A549、HL-60和HeLa細胞系的增殖抑制率分別為46.16%、44.97%、44.95%和33.10%。Wang等［6］以甘油（GCP-1）和粗甘油（GCP-2）為輔助營養(yǎng)成分，利用內生真菌C. globosumCGMCC 6882進行生物合成分別得到GCP-1和GCP-2兩個多糖樣品，活性研究發(fā)現(xiàn)該多糖對人類肺癌A549細胞系具有良好抑制活性。本課題組曾對川貝母內生真菌Fusariumsp. A14的EPS進行了系列分離純化并得到兩個均一多糖A14EPS-1和A14EPS-2，抗腫瘤細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)A14EPS-2表現(xiàn)出中等的抑制人肝細胞癌HepG2細胞系的活性［22］。相對小分子天然產物而言，多糖的抗腫瘤活性較弱，但是，由于PSEF產量比小分子化合物高數(shù)十倍，甚至上百倍，且毒性低，使得從內生真菌中篩選和開發(fā)具有抗腫瘤活性的多糖具有重要的理論和實際意義。

4.2 抗氧化

氧自由基，又稱為活性氧（Reactive oxygen species，ROS），是普遍存在于人和動植物體內的代謝副產物［45］。過量的活性氧會引發(fā)細胞膜磷酸酯質過氧化，蛋白質氧化，核酸損傷和酶的失活，誘發(fā)細胞調亡等［46］，從而引起一系列疾病，如癌癥、不育癥、心臟病、阿爾茨海默病等，而且還會加速生物體衰老［47-49］。從自然界中尋找高效、安全低毒的抗氧化劑就顯得十分重要。研究表明，PSEF具有廣泛的抗氧化活性，是一類極其重要的抗氧化劑來源。Chen等［8］對一株紅樹林內生真菌Aspergillussp. Y16的EPS研究，得到均一多糖成分As1-1，其具有良好的二苯基苦酰肼基（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧自由基清除能力。Li等［4］對從盾葉薯蕷內生真菌F. oxysporiumDzf17代謝產物中得到的EPS、水提取菌絲多糖（WPS）和氫氧化鈉提取的菌絲體多糖（SPS）的抗氧化測定發(fā)現(xiàn)，SPS多糖抗氧化活性最強，其DPPH自由基清除活性EC50為63.37μg/mL，亞鐵離子螯合活性EC50為44.91 μg/mL。Mahapatra 和 Banerjee［21］對一株從糖膠樹Alstonia scholaris分到的內生真菌F. solaniSD5的均一胞外多糖成分PS-I的抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)該多糖具有較強清除DPPH自由基的活性，而且安全無毒，是一種潛在的無毒外源抗氧化劑。本課題組對川貝母內生真菌A14的兩個均一胞外多糖A14EPS-1和A14EPS-2抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，其均表現(xiàn)出對DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性［22］。Wang等［50］發(fā)現(xiàn)分離自當歸的內生真菌Alternaria tenuissimaF1的EPS表現(xiàn)出較強超氧陰離子和羥基自由基清除活性，而且還具有良好的還原活性。此外，本課題組研究了多株分離自瓦布貝母的內生真菌的EPS發(fā)現(xiàn)，其均具有一定的清除自由基等抗氧化活性［19，39］。綜上可見，植物內生真菌多糖的抗氧化活性普遍存在，這不僅有助于PSEF在醫(yī)藥和食品保健品等領域的開發(fā)與利用，而且，自由基或活性氧在植物體內表現(xiàn)出廣泛的生理生化作用，探索該類多糖抗氧化能力在與植物共生過程中所起作用的研究也非常有意義。

4.3 抗菌

Wang等［40］研究發(fā)現(xiàn)，分離自中藥植物絞股藍的內生真菌能夠產生抗菌活性多糖，通過分離純化得到均一多糖GCP，其通過破壞內膜和增加細胞滲透性發(fā)揮抗菌活性，但對細胞壁沒有影響，該多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.75和0.67 mg/mL。Zeng等［20，43］從來源于鐵皮石斛莖中內生真菌F. solaniDO7發(fā)酵產物中分離到兩個多糖DY1和DY2，均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，特別是對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有很強的抑制活性。但是本課題組對多株川貝母內生真菌多糖進行了抗菌研究，未發(fā)現(xiàn)其多糖有抗菌作用，說明并非所有多糖都具有此類活性。

4.4 其它活性

除上述生物活性外，研究還發(fā)現(xiàn)PSEF還具有抗炎、抗過敏、免疫增強、益生元等生物活性。Mahapatra和Banerjee研究了內生真菌F. solaniSD5均一胞外多糖PS-I在不同劑量飼養(yǎng)大鼠30 d后腸（糞）細菌的濃度，與對照相比，發(fā)現(xiàn)可顯著降低Clostridium perfringens的濃度［32］。進一步研究發(fā)現(xiàn)多糖PS-1在劑量濃度為10、100和1 000 μg/mL時，膜穩(wěn)定化的百分比分別為27.46±4.22%、45.08±2.80%和55.05±5.68%，二者間呈顯著相關性，且多糖PS-1活性與標準藥物吲哚美辛相當，可見PS-I可保護細胞膜免受有毒物質的影響，并通過抑制炎癥介質形成來干擾早期炎癥反應；對體外大鼠腸系膜肥大細胞保護研究表明，與對照相比，化合物48/80在劑量濃度為4 μg/mL時使肥大細胞發(fā)生脫離，而多糖PS-1可以抑制化合物48/80介導的肥大細胞脫離，并表現(xiàn)出明顯的量效關系。因為化合物48/80是肥大細胞中強有力的組胺釋放劑，多糖PS-1具有顯著的肥大細胞穩(wěn)定活性，從而間接抑制了組胺釋放，表現(xiàn)抗過敏活性［41］。Li等［24］對藏紅花內生真菌P. citreonigrumCSL-27的粗胞外多糖進行了分離純化，得到一個均一水溶性胞外多糖EPS-2，發(fā)現(xiàn)該多糖顯著減弱慶大霉素誘導的HEIOC1細胞損傷，增加斑馬魚細胞的存活率，顯示出保護耳蝸毛細胞免受毒性物質侵害的活性。Zeng等［20］對鐵皮石斛內生真菌F. solaniDO7產生的兩個多糖DY1和DY2活性研究發(fā)現(xiàn)，DG2對人胚腎細胞無明顯細胞毒作用，還可增加TNF-α、IL-6和iNOs mRNA的表達，而這可進一步促進RAW264.7中TNF-α、IL-6和NO的產生，可見DG2具有強大的免疫活性。

5 內生真菌多糖與宿主植物間的作用

植物為其內生真菌提供營養(yǎng)和生活場所，同樣部分內生真菌也能幫助宿主植物抵抗逆境，甚至影響宿主植物的生長發(fā)育［51］。越來越多的研究表明PSEF不僅具有廣泛的體外生理活性，而且還能夠刺激宿主或非宿主植物某些化合物的產生或者產量的增加。例如，Li等［52］研究了內生真菌Dzf12的EPS、WPS和NaOH提的SPS以及通過水解作用分別得到 EOS（EPS-derived oligosaccharide）、WOS（WPS-derived oligosaccharide） 和 SOS（SPS-derived oligosaccharide）3種低聚糖共6種糖對盾葉薯蕷無菌苗和盾葉薯蕷細胞懸浮培養(yǎng)時合成薯蕷皂苷元的影響，發(fā)現(xiàn)其均可提高薯蕷皂苷元產量，但是受多糖濃度影響明顯，其中濃度為20 mg/mL的EOS可使細胞合成的薯蕷皂苷元產量提高6.88倍。同樣，從盾葉薯蕷中分離得到的另外一株內生真菌F.oxysporiumDzf17的EPS、WPS和NaOH提的SPS也均有提高盾葉薯蕷細胞懸浮培養(yǎng)時薯蕷皂苷元的產量，其中以水提多糖的促進作用最強［17］。丹參根部內生真菌Trichoderma atrovirideD16不僅本身可以產生丹參酮I（T-I）和丹參酮IIA［29］，而且該菌株多糖可刺激其宿主植物丹參毛狀根的生長和宿主植物細胞丹參酮I（T-I）和丹參酮IIA的生物合成［28］。從苦蕎分離得到的一株內生真菌F. oxysporumFat9菌絲多糖和EPS也均可刺激宿主植物黃酮類產物的積累，同時提高苦蕎麥提取物的抗氧化活性［36］。內生真菌Gilmaniellasp. AL12可刺激Atractylodes lancea產生揮發(fā)油，深入研究發(fā)現(xiàn)該菌株產生的甘露聚糖有助于該菌株和A. lancea之間形成拮抗平衡，甘露聚糖的一部分被降解為甘露糖以進行己糖激酶活化，促進光合作用和能量代謝，潛在的代謝通量流向萜類生物合成；另一部分通過G蛋白介導的信號轉導和甘露聚糖結合凝集素途徑直接增強了A. lancea的自身免疫，在隨后的防御反應中促進了揮發(fā)油的積累［23］?？梢姡瑑壬婢嗵浅煞衷谄渑c宿主植物相互作用的過程中扮演了重要作用。

6 展望

內生真菌是一類極其重要的微生物資源，具有非常豐富的生物多樣性，而且每種內生真菌均具有產多糖能力，也使得內生真菌產生的多糖具有廣泛的多樣性。目前，大型真菌多糖的研究相對較多，部分多糖結構也基本明確，而且由于多種大型真菌本身就作為食物長期使用，開發(fā)出的大型真菌多糖產品（如香菇多糖片等）市場接受度好。自1993年，Stierle等［53］從內生真菌中發(fā)現(xiàn)可以產紫杉醇的菌株開始，內生真菌才廣泛的引起人們的注意。而內生菌多糖的研究只有幾十年的歷史，研究還相對落后。例如，內生真菌據(jù)推測有100萬種左右［54］，但到目前為止，根據(jù)不完全統(tǒng)計分離得到的內生真菌均一多糖不足40個（表1）。關于多糖結構、活性、工業(yè)化生產、產品開發(fā)等方面內生真菌還遠不如大型食用真菌。但是，在大型真菌上的研究成果可以為內生真菌多糖的開發(fā)提供借鑒。而且，大型真菌主要屬于擔子菌亞門，少數(shù)屬于子囊菌亞門，國內報道的食用菌不到100種，有藥用價值的真菌僅有30多種［55］，大型食用真菌多糖主鏈主要為葡聚糖和甘露聚糖［56］，而植物內生真菌無論在生物多樣性上還是在其多糖類型上都遠多于大型真菌。同樣PSEF和其它類型真菌多糖一樣，也具有廣泛的生理活性，表現(xiàn)出極大的開發(fā)價值。加強對內生真菌多糖的研究，有助于內生真菌多糖產物的開發(fā)利用。

內生真菌可以與植物和諧共存，而多糖作為內生真菌產量較大的天然產物之一，對植物和內生真菌間相互作用產生重要影響，加之多糖所具有的多重生理功能，如信號調節(jié)、免疫增加、滲透壓調節(jié)等，使得以PSEF為化學物質基礎來探討植物與內生真菌間相互作用的機制具有重要意義。目前，此類研究較少，僅有通過體外獲得PSEF，然后將其作為植物或植物細胞等培養(yǎng)的添加劑，以促使植物或植物細胞增加抗逆活性，刺激特定化合物產量提高。加強植物內生真菌多糖在內生真菌與宿主植物間相互作用中所扮演角色的研究，不僅有助于理解內生真菌如何避免植物免疫體系的作用又不對植物造成損害，而且還有助于利用多糖產物間接影響宿主植物生長發(fā)育。

內生真菌在脫離原來的生活環(huán)境后，在反復的純培養(yǎng)過程中，會發(fā)生菌株的退化，這會導致內生真菌代謝發(fā)生改變。例如，從平貝母中分離到的內生真菌P7在反復培養(yǎng)后其產生物堿的能力就大大下降［57］。但是至今未見研究內生真菌在退化過程中其產多糖能力改變的相關報道。此外，盡管內生真菌可產生豐富的多糖，但是目前仍缺少將其投入到工業(yè)化生產的實例，加強對其開發(fā)力度也很有必要。

總之，目前關于PSEF研究尚處于起步階段，以內生真菌為出發(fā)點，研究其多糖結構、生物學、生理生化等方面的功能正在成為內生真菌研究的一個熱點，也必將取得豐碩成果。