聚羥基丁酸酯合成引發(fā)的高密度生長大腸桿菌的多位點突變分析

陳橋 吳海英 王宗壽 謝雨康 李宜青 孫俊松，3

（1. 中國科學院上海高等研究院，上海 201210；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 上?？萍即髮W，上海 201210；4. 福建省南平市畜牧站，南平 353000）

全世界已經(jīng)生產(chǎn)和消費了上億噸塑料產(chǎn)品［1］。由于塑料垃圾不能自然降解而日積月累，對地球造成越來越大的生態(tài)危機［2］。隨著公眾對環(huán)境惡化和資源消耗的日益關(guān)注，近年來利用生物技術(shù)生產(chǎn)可降解聚合物替代制品受到了廣泛關(guān)注［3］。

聚羥基脂肪酸（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一些微生物在營養(yǎng)不均衡的條件下生長時，在胞內(nèi)合成的高分子聚合物［4］，作為胞內(nèi)能量儲存物［5］。PHAs的物理性質(zhì)會因其化學組成和重復單元數(shù)量不同而各不相同［6］。聚3-羥基丁酸酯（Poly-3-hydroxybutyrate，PHB）是自然界最常見的 PHAs［7］。文獻報道，將來自羅氏真養(yǎng)菌產(chǎn)PHB的操縱子phaCAB外源表達到大腸桿菌，重組大腸桿菌可以合成PHB。同樣，在釀酒酵母和蠟狀芽孢桿菌也實現(xiàn)了PHB的異源合成［8］。

羅氏真養(yǎng)菌中PHB的合成途徑是從乙酰輔酶A開始，經(jīng)phaA編碼的β-酮基酯酞輔酶A硫解酶催化兩個乙酰輔酶A產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶A；再由phaB編碼依賴于NADPH的乙酰乙酰輔酶A還原酶，催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為羥基丁酰輔酶A；最后由聚羥基脂肪酸聚合酶（phaC）將羥基丁酰輔酶A單體聚合形成PHB。盡管重組大腸桿菌PHB發(fā)酵生產(chǎn)的水平已大幅提升，但與石油工業(yè)的衍生聚合物相比，PHB的微生物生產(chǎn)仍面臨成本高的問題。因此，一些研究策略，如優(yōu)化發(fā)酵工藝、使用農(nóng)業(yè)廢棄物等廉價碳源［9］及進一步改造生產(chǎn)菌株仍然十分必要。在菌株的改造中，除了需要敲除副產(chǎn)物生成的競爭途徑，優(yōu)化碳源代謝流及乙酰輔酶A的分配，增加還原力輔因子NADPH的供給也顯著影響PHB的合成效率［10］。

此外，增加細胞密度也是提高PHB生物合成量的有效手段。研究發(fā)現(xiàn)，影響細胞密度的重要因素之一是發(fā)酵液中積累大量的有機酸，而其產(chǎn)生與pH值和培養(yǎng)基的組成成分相關(guān)。當培養(yǎng)基中碳源濃度高于生長需求時，富余碳源不被充分氧化產(chǎn)生二氧化碳，此部分碳代謝流會走向有機酸的合成，其中主要包括乙酸［11］。大腸桿菌在營養(yǎng)均衡的培養(yǎng)基以及微酸性發(fā)酵條件（pH 6.0-7.0）下產(chǎn)乙酸濃度較低，此條件下有利于細胞密度的增加。其他相關(guān)條件，尤其是碳源濃度直接影響大腸桿菌碳代謝途徑的網(wǎng)絡調(diào)控。例如，在大腸桿菌JM109中，高濃度的葡萄糖會抑制丙酮酸脫氫復合體參與其分解物丙酮酸的進一步氧化，轉(zhuǎn)而利用丙酮酸氧化酶（poxB）途徑脫羧生成乙酸［12］。細胞內(nèi)的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如Cra、Crp和ArcA，也被證明與碳代謝和細胞密度有關(guān)［13］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，各亞種的大腸桿菌菌株均可用于PHB的生產(chǎn)，但即使使用完全相同的表達策略，某些菌株仍表現(xiàn)出相對較高的PHB產(chǎn)量。此前我們獲得了一株大腸桿菌S17-3，它是模型菌株S17-1的實驗室自發(fā)突變株。在富含碳源的培養(yǎng)基中，表達phaCAB的S17-3轉(zhuǎn)化子比其他大腸桿菌具有更好的生長性能［14］。針對大腸桿菌在PHB合成中展現(xiàn)的碳源利用率的提升，以及高密度培養(yǎng)的特異表型，十分有必要對該突變株進行深一步的研究，本研究借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序分析等手段，發(fā)現(xiàn)了葡萄糖代謝通路中的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（pgi）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（zwf）基因?qū)τ赟17-3的高密度生長性能和PHB生產(chǎn)起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒信息以及PCR 所用的模板及引物序列等信息如表1 所列，大腸桿菌S17-3為實驗室保存的實驗菌株；全基因組掃描測序及比對分析，上海美吉生物公司；轉(zhuǎn)錄組學測序及數(shù)據(jù)初步統(tǒng)計，生工生物工程（上海）股份有限公司；基因組DNA提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒等，杭州愛思進生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶，康為世紀生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI，賽默飛世爾科技公司；Phanta高保真DNA聚合酶、一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。S1000TMPCR擴增儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限責任公司；Tanon EPS30電泳槽及Gel DocTM XR+全自動凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限責任公司；NANODROP 2000c微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；高速冷凍離心機，艾本德生命科學儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱及恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

表1 菌株，質(zhì)粒和引物

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)均使用LB培養(yǎng)基:10 g/L 氯化鈉，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L酵母浸取物；發(fā)酵產(chǎn)PHB的培養(yǎng)基為添加了20 g/L葡萄糖，20 g/L乳糖，20 g/L甘油的LB培養(yǎng)基。在實驗需要時，添加的氨芐青霉素（Amp）濃度為100 μg/mL。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 以引物對CAB-F和CAB-R進行高保真PCR得到目標phya-CAB表達載體（引物序列見表1），將得到的PCR產(chǎn)物進行清潔并測定濃度。用BamH I和XhoI快切酶將質(zhì)粒pBluescript II SK（+）線性化，在37℃中反應2 h后進行清潔并測定濃度。將清潔后的質(zhì)粒和片段通過一步克隆試劑盒進行連接，之后立即進行轉(zhuǎn)化。

1.2.3 大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)方法 從大腸桿菌LB平板上挑取單克隆到3 mL的液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。按1%的接種量轉(zhuǎn)接到盛有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角燒瓶里，置于37℃，200 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)，3-4 h待OD600到0.5-0.6左右，取出置于冰上預冷。于此同時，將電轉(zhuǎn)杯，冷凍離心機，無菌水，無菌EP管也都預冷上。將預冷好的菌液放入預冷的冷凍離心機（4℃）中，5 500 r/min，7 min，去上清，留下菌體。用預冷的無菌水洗滌菌體3次后，用300 μL無菌水打勻菌體，分裝到預冷的1.5 mL EP 管中。轉(zhuǎn)化操作時，將2.0 μL DNA片段加入100 μL 感受態(tài)細胞中，混勻后冰浴10 min。設置電轉(zhuǎn)電壓為2.5 KV，空擊時間為6.0 ms。電轉(zhuǎn)操作后，加入700 μL 37℃的 LB培養(yǎng)基復蘇，置于37℃恒溫搖床，1 h。獲得轉(zhuǎn)化子后，挑取單菌落進行PCR驗證，引物來自所構(gòu)建質(zhì)粒的同源片段［15］。

1.2.4 大腸桿菌基因敲除方法 本研究使用了Red的同源重組方法進行基因敲除。Red重組系統(tǒng)由3個基因編碼，分別是exo，bet和gam。Exo是5'-3'核酸外切酶，可以作用于雙鏈DNA，Bet是單鏈DNA結(jié)合蛋白，Gam抑制RecBCD核酸外切酶的活性。在大腸桿菌（Escherichia coli）以及釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）中，Red重組酶可以使同源序列長只有35 bp的DNA片段與細菌的染色體發(fā)生同源重組，從而實現(xiàn)對細菌的定點改造。Red重組通常會在染色體基因上留下抗性標記基因，抗性標記基因的存在有可能會影響其生物學功能。利用FLP/FRT系統(tǒng)可以有效的解決該問題。本研究中使用的是帶有Red基因的質(zhì)粒pKD46以及帶有flp的重組酶的質(zhì)粒pCP20。為了提高敲除效率，本研究使用的同源臂為300 bp，通過overlap PCR方法得到帶有同源臂及抗性篩選基因的敲除片段。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵實驗 將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的S17-3菌株轉(zhuǎn)接入搖瓶進行發(fā)酵。首先在平板上挑取單克隆，轉(zhuǎn)接到3 mL帶有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)8-12 h，再將500 μL培養(yǎng)液接入裝有50 mL LB的500 mL搖瓶中（1%的接種量）。將已滅菌的葡萄糖、乳糖或甘油分別加入LB培養(yǎng)基，使各自的終濃度達到20 g/L。置于37度搖床培養(yǎng)，24 h，200 r/min。

1.2.6 全基因組掃描測序及比對分析 菌株S17-3全基因組掃描測序采用的是Illumina PE測序。測序工作由上海美吉生物公司完成。對測序所得到的基因組序列進行SNP（單核苷酸多態(tài)性）和Indel（插入缺失突變）分析。BW25113在線基因組信息網(wǎng)址 為:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/NZ_CP009273?report= genbank&log$=nuclalign&blast_rank=4&RID=4PSGBGX501R

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組學測序及比對分析 總RNA的提取:按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行提取。隨后進行轉(zhuǎn)錄組學測序上機前樣品準備，流程:（1）rRNA去除:使用試劑盒Ribo-off rRNA Depletion Kit，具體操作步驟簡寫如下:a. 準備總RNA樣品；b. RNA樣品與探針雜交；c. RNase H消化；d. DNase I 消化；e. rRNA-depleted RNA 純化。（2）IncRNA 文庫構(gòu)建:使用試劑盒VAHTSTM Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for illumina?，具有的操作步驟簡寫如下:a. IncRNA片段化；b. 雙鏈cDNA合成；c. 末端dA-Tailing；d.接頭連接；e. 連接產(chǎn)物純化與片段大小分選；f. 文庫擴增。（3）文庫質(zhì)檢:使用8%的PAGE膠電泳檢測。（4）定量混合:為了方便等量混合便于上機檢測，對回收的DNA進行精準定量，使用的是Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒。轉(zhuǎn)錄組學測序由上海生工生物有限公司完成，并對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行基因差異表達分析。

2 結(jié)果

2.1 不同碳源條件下的大腸桿菌高密度生長

大腸桿菌在正常的搖瓶發(fā)酵條件下，其培養(yǎng)液最終的OD600一般約為5-10。本研究中的大腸桿菌突變菌株S17-3在含有表達質(zhì)粒pBhya-CAB（S173-H）時，可以在不同碳源的LB培養(yǎng)基中表現(xiàn)出高密度生長的特性，而含有pBhya-CAB的模式菌株BW25113的轉(zhuǎn)化株（BW25113-H）并未表現(xiàn)出同樣的生長特性。作為對照，S17-3和BW25113同時表達了不含phaCAB操縱子的空載質(zhì)粒pBluescript II SK（+）（S173-P）。如圖 1所示，S17-3在表達pBhya-CAB且發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同碳源時，葡萄糖（Glu）作為碳源的OD600最高，可達40左右，乳糖（Lac）和甘油（Gly）作為替代碳源，其培養(yǎng)液的最高OD600也達到35左右。而對照菌株，含有空載質(zhì)粒pBluescript II SK（+）的S17-3轉(zhuǎn)化株，及其它相應的對照株，其最高OD600均低于10。

圖1 大腸桿菌各菌株的生長密度的測量

2.2 全基因組掃描測序及轉(zhuǎn)錄組測序分析

為了揭示大腸桿菌菌株S17-3在表達質(zhì)粒pBhya-CAB表現(xiàn)出高密度生長特性的機理。本研究將S17-3全基因組掃描測序后同BW25113比對分析，發(fā)現(xiàn)兩株菌的遺傳差異較大，它們在碳代謝、糖的轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)錄等重要功能基因上存在序列差異，如pgi、cyaA等，pgi是編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，催化6P-葡萄糖合成6P-果糖，參與糖酵解代謝以及參與可拉酸的其中一種單糖巖藻糖的合成；cyaA編碼腺苷酸環(huán)化酶，在碳代謝調(diào)控網(wǎng)絡中起關(guān)鍵作用，總結(jié)如表2所示。其中，S17-3中的基因pgi發(fā)生了點突變，722位的堿基C變成了T，造成非同義突變（堿基的改變影響氨基酸的表達），丙氨酸（GCG編碼）突變成了纈氨酸（GTG編碼）。另外，點突變的基因還包括調(diào)控蛋白GalB，半乳糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的GatB；而存在移框突變的蛋白有TtdB（酒石酸脫水酶β亞基）、GalR（LacI 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白）等，但是對上述基因進行缺失操作后，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳性狀改變（數(shù)據(jù)未顯）。

此外，本研究對兩種培養(yǎng)方式下獲得的細胞進行了轉(zhuǎn)錄組學測序及比對分析，分別是菌株S17-3/pBhya-CAB（發(fā)酵加葡萄糖）（記為S173-H），S17-3/pBluescript II SK（+）（發(fā)酵加葡萄糖）（記為S173-P），進行了轉(zhuǎn)錄組學測序，每個樣品2個平行。測序報告及比對分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的基因所編碼的蛋白主要參與糖的轉(zhuǎn)運，應激反應以及與氨基酸合成相關(guān)的代謝途徑，下調(diào)部分的基因主要編碼一些糖苷轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)運蛋白，總結(jié)如圖2所示。據(jù)文獻報道，PHB的合成需要消耗大量的輔酶因子NADPH，而NADPH細胞內(nèi)的主要來源之一是戊糖磷酸途徑?；騴wf是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，編碼6P-葡萄糖脫氫酶，催化6P-葡萄糖合成6P-葡萄酸內(nèi)脂，因此考察Zwf的表達量可以用來預測PPP途徑的代謝流量。

表2 全基因組掃描測序及比對分析

圖2 轉(zhuǎn)錄組測序分析

2.3 突變菌株的生長曲線

為了研究基因Pgi突變帶來的影響，在菌株S17-3和BW25113中，利用Red同源重組系統(tǒng)敲除基因pgi，得到突變菌株S17-3/Δpgi和BW25113/Δpgi。在相同的培養(yǎng)條件下發(fā)酵菌株BW25113，S17-3，BW25113/Δpgi和 S17-3/Δpgi。實驗結(jié)果如圖 3-A所示，S17-3敲除Pgi的菌株生長變得遲緩，但其最大OD600值和野生型沒有顯著差異。BW25113敲除Pgi的菌株生長得到改善，其最大OD600值（約9.0）也優(yōu)于野生型（約5.0）。同樣，在上述的培養(yǎng)條件下發(fā)酵菌株 S17-3/Δpgi/pBhya-CAB（S173/Δpgi-H），S17-3/pBhya-CAB（S173-H），BW25113/Δpgi/pBhya-CAB（BW25113/Δpgi-H）以及 BW25113/pBhya-CAB（BW25113-H）。實驗結(jié)果如圖3-B所示，S173/Δpgi-H相比S173-H同樣生長變得遲緩，但其最大OD600值沒有顯著差異。而BW25113/Δpgi-H相比于BW25113-H的生長性能有明顯提升，最大OD600值為15左右。

為了研究Zwf對S17-3高密度生長的影響，在S17-3和BW25113中分別敲除zwf，得到突變菌株S17-3/Δzwf和 BW25113/Δzwf。在上述的培養(yǎng)條件下發(fā) 酵 菌 株 S17-3/Δzwf，BW25113/Δzwf，S17-3/Δzwf/pBhya-CAB（S173/Δzwf-H） 和 BW25113/Δzwf/pBhya-CAB（S173/Δzwf-H）。 實 驗 結(jié) 果 如 圖 3-C 所 示，S173/Δzwf-H的生長受到影響，最大OD600值約為20.0，其他敲除zwf的菌株最大OD600值與野生型無顯著差異。

3 討論

隨著地球資源日益減少，利用微生物發(fā)酵技術(shù)替代化學資源生產(chǎn)大宗化學品及可降解材料是研究的熱門和重點之一。微生物的高密度生長對發(fā)酵產(chǎn)物的提高往往至關(guān)重要，而微生物通常會通過其復雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡對細胞生長密度進行微妙而精確的調(diào)控，在不進行發(fā)酵干預的情況下，其最終培養(yǎng)密度往往不是很高。在本研究中，我們通過在一株大腸桿菌突變菌株S17-3中表達質(zhì)粒pBhya-CAB，獲得了高密度生長的重組大腸桿菌。借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)pgi有基因突變和轉(zhuǎn)錄水平的改變，zwf則在轉(zhuǎn)錄水平上有改變。在S17-3和BW25113中分別敲除pgi和zwf，結(jié)果顯示S17-3敲除pgi后，菌株生長會變得緩慢，但最大OD600值無顯著差異；BW25113敲除pgi后，菌株的生長性能得到改善，表達pBhya-CAB時最大OD600值較之前提升了約3倍。S17-3敲除zwf后，菌株生長性能受到影響，表達pBhya-CAB時最大OD600值降低了約1倍。BW25113敲除zwf后，菌株生長變緩慢，但最大OD600值無明顯差異。

圖3 大腸桿菌敲除Pgi和Zwf的生長曲線

研究發(fā)現(xiàn)，如圖4的代謝示意圖所示，pgi的敲除能提高菌體內(nèi)的磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway），導致細胞內(nèi)的輔酶NADPH濃度上升，而在PHB的生物合成過程中，PhaB催化需要消耗大量輔酶NADPH，從而可以提升乙酰CoA合成PHB的碳代謝支流，解釋了研究中發(fā)現(xiàn)的敲除pgi且同時表達PHB基因時，菌株為何能高密度生長，同時高水平表達PHB的生理現(xiàn)象［16］。此外，之前的研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)乙酸水平低，也可能是由于乙酰CoA積累變少造成的。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，基因zwf的敲除不利于大腸桿菌轉(zhuǎn)化株在高碳源培養(yǎng)基中的高密度生長（相比S17-3-H），這應該是由于，該突變會阻斷磷酸戊糖途徑，降低細胞內(nèi)的輔酶NADPH［17］，形成與pgi突變相反的代謝效果（代謝路徑如圖4所示）。

4 結(jié)論

通過在大腸桿菌中表達質(zhì)粒pBhya-CAB，本研究獲得了一株高密度生長的重組大腸桿菌菌株，無發(fā)酵調(diào)控情況下，培養(yǎng)液的最大OD600值可達到40左右。借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株S17-3的pgi有基因突變和轉(zhuǎn)錄水平的改變，zwf有轉(zhuǎn)錄水平的改變。在S17-3和BW25113中分別敲除pgi和zwf后，大腸桿菌在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出細胞密度的改變，提示S17-3的碳代謝流的分配調(diào)控網(wǎng)絡與其他大腸桿菌菌株有明顯不同，需要進一步深入的研究。

圖4 本研究中所涉及大腸桿菌的相關(guān)碳代謝流走向圖