鞘氨醇激酶1通過ERK1/2信號通路促進非小細胞肺癌細胞的侵襲和遷移*

呂冰潔， 安 超， 郝 東， 王 濤， 王曉芝， 李洪波， 楊 陽

（濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1呼吸與重癥醫(yī)學科，2臨床營養(yǎng)科，3全科醫(yī)學科，山東濱州256603）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，全球肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的約 80%［1］。盡管早期檢測和標準治療取得了進展，但NSCLC 在確診時常常為晚期且預后不良［2］，因此，揭示NSCLC的分子機制和鑒定新的生物標志物可能對NSCLC的診斷和治療非常重要。

鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）可將鞘氨醇轉化為鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P），后者是一種重要的在腫瘤發(fā)生中調節(jié)細胞過程的生物活性脂質介體［3］，因此，SphK 也可能在腫瘤的進展中發(fā)揮關鍵作用。2 種功能性SphK 同種型（SphK1 和SphK2）已在哺乳動物細胞中被鑒定和描述特征［4］。研究顯示，許多腫瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌和結腸癌）存在SphK1 的過度表達，且其與腫瘤的發(fā)展和患者的生存密切相關［5-8］。然而SphK1 是否參與NSCLC 的侵襲和轉移及其機制尚不完全明確。Hojjat 等［9］和 Liu 等［10］分別在結腸癌細胞系LoVo和HT-29中發(fā)現SphK1可以促進細胞增殖和侵襲并抑制細胞凋亡，其機制可能與ERK1/2 信號通路的激活有關，故我們猜測SphK1 可以促進NSCLC的侵襲和轉移，且這種作用可能與激活ERK1/2 信號通路有關。因此，本研究檢測了SphK1 在NSCLC 臨床標本中的表達，觀察了SphK1 在NSCLC 細胞侵襲和遷移中的作用，并試圖揭示其潛在機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 臨床標本 本研究經濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準。收集31 名NSCLC 患者腫瘤組織和匹配的正常肺組織。這些患者術前均未接受任何化療或放療。這些組織樣本立即在液氮中儲存或用甲醛固定以進行免疫組織化學染色。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞系A549 購自中國科學院細胞庫。將細胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.1 mg/L 鏈霉素和1×105U/L 青霉素的DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑和儀器 ERK1/2 抑制劑U0126（Cell Signaling Technology）以 20 μmol/L 預處理 A549 細胞 30 min；用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理對照組?？?SphK1、E-cadherin、fibronectin 和 β-actin抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的 II 抗購自 Santa Cruz；抗 p44/42 MAPK（ERK1/2）和p-ERK1/2 抗體購自Cell Signaling Technology；TRIzol 試劑、cDNA 合成試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。NanoDrop 2000 分光光度計購自Thermo Scientific。

2 主要方法

2.1 RT-qPCR 根據制造商的說明書，使用TRIzol試劑提取總RNA；通過NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA 濃度和純度；使用cDNA 合成試劑盒將2 μg總RNA 逆轉錄為cDNA。SphK1 的上游引物序列為5'-GGCTGCTGTCACCCATGAA-3'，下游引物序列為5'-TCACTCTCTAGGTCCACATCAG-3'；β-actin 的上游引物序列為5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3'，下游引物序列為5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'。RT-qPCR 條件如下:95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。最后，使用2-ΔΔCt法計算SphK1相對于β-actin的mRNA表達水平。

2.2 Western blot 實驗 使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液提取細胞裂解物，通過BCA 法評估總蛋白質的濃度。使用SDS-PAGE 凝膠分離等量的蛋白質，再將蛋白質轉到PVDF膜上。使用TBST［10 mmol/L Tris（pH 7.4）、100 mmol/L NaCl和5%Tween-20］中稀釋的5%牛血清白蛋白封閉PVDF 膜，加入I 抗［抗SphK1 抗體（1∶500），抗 E-cadherin 抗體（1∶500），抗 fibronectin 抗體（1∶250），抗p44/42 MAPK（ERK1/2）抗體（1∶1 000），抗p-ERK1/2抗體（1∶1 000），抗β-actin 抗體（1∶1 000）］4℃孵育過夜。將膜與HRP 標記的II抗在室溫下孵育1 h，ECL顯影。顯影結果采用Image-Pro Plus 6.0 進行圖像分析。

2.3 細胞轉染 對于SphK1 的過表達，我們委托GenePharma 公 司構建含SphK1基因的 pcDNA3.1 載體pcDNA3.1-SphK1（SphK1 組），以空pcDNA3.1 載體為陰性對照（NC組）。根據制造商的說明，使用Lipofectamine? 2000 試劑將 pcDNA3.1-SphK1 載體或空 pcDNA3.1 載體轉染 A549 細胞，48 h 后進行后續(xù)實驗。

對于SphK1的敲減，我們設計靶向SphK1基因的siRNA（siSphK1 組），其序列為5'-GCAGGCAUAUGGAGUAUGA-3'，以亂序 siRNA 為陰性對照（siNC組）。使用 Lipofectamine? 2000 試劑將 siSphK1 或siNC轉染A549細胞。48 h后，細胞用于后續(xù)實驗。

2.4 細胞侵襲和遷移實驗 細胞侵襲實驗于具有Transwell 小室的24 孔板中進行，小室底部為孔徑8 μm 的有孔聚乙烯膜（Costar）。用50 μL Matrigel（1 mg/L）包被Transwell小室底部膜的內表面，調整細胞密度為 1.0×105個將 200 μL 含 1% FBS 的細胞懸液置于上室，24 孔板下室加入 600 μL 含 30%FBS 的細胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的潮濕環(huán)境中溫育16 h。16 h 后，非侵入性的細胞用棉簽移除，穿過涂有Matrigel 的膜向下遷移的細胞用4%甲醛固定和結晶紫染色，然后在光學顯微鏡（×200）下拍照。選擇7個隨機視野進行細胞計數，計算平均數以反映細胞侵襲能力。除未在Transwell 小室底部膜表面鋪Matrigel，遷移實驗與侵襲實驗方法一致。

3 統(tǒng)計學處理

每項實驗重復3 次。使用SPSS 17.0 軟件分析。正態(tài)分布的計量資料表示為均數±標準差（mean±SD）。兩組之間均數比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SphK1在NSCLC組織中高表達

RT-qPCR結果顯示，與癌旁肺組織相比，NSCLC組織中SphK1 的mRNA 表達顯著上調（P＜0.01），見圖1A。為了分析 31 例 NSCLC 患者 SphK1 mRNA 表達水平與臨床病理參數的關系，基于1.5 倍上調的截斷值，將樣本分成2 組:SphK1 高表達組（n=17）和SphK1 低表達組（n=14）。晚期NSCLC 患者的SphK1表達水平顯著升高（P=0.012），而SphK1表達水平在患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤組織學類型和吸煙狀況等方面的差異無統(tǒng)計學意義，見表1。另外，RT-qPCR 結果表明，SphK1 的 mRNA 表達水平隨著腫瘤TNM 分期進展而增加，IV 期最高，I 期最低（P＜0.01），見圖1B。

2 SphK1促進NSCLC細胞的侵襲和遷移

轉染pcDNA3.1-SphK1 載體可使A549 細胞過表達SphK1，而siSphK1則抑制A549細胞中SphK1表達（P＜0.01），見圖2A、B。過表達 SphK1 可促進 A549細胞的侵襲和遷移（P＜0.01），而敲減SphK1則抑制了A549細胞的侵襲和遷移（P＜0.05），見圖2C、D。

Figure 1.Correlation between SphK1 expression and NSCLC progression.A:the mRNA expression of SphK1 in NSCLC tissues and adjacent lung tissues（n=31）；B:the mRNA expression of SphK1 in NSCLC tissues at I/II（n=14）and III/IV（n=17）stages.Mean±SD.**P＜0.01 vs adjacent tissues；##P＜0.01 vs I/II stages.圖1 SphK1對NSCLC進展的影響

表1 NSCLC患者不同SphK1水平臨床病理參數比較Table 1.Correlation analysis between SphK1 level and clinicopathological parameters in NSCLC patients

Figure 2.SphK1 promoted invasion and migration of NSCLC cells.A:the protein level of SphK1 was detected by Western blot analysis；B:SphK1 mRNA level was detected by RT-qPCR；C:effect of SphK1 on migration of A549 cells；D:effects of SphK1 on invasion of A549 cells.Scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs siNC group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.圖2 SphK1促進NSCLC細胞的侵襲和遷移

3 ERK1/2 途徑參與細胞侵襲和遷移，并調節(jié)上皮-間 充 質 轉 化（epithelial-mesenchymal trasition，EMT）相關基因的表達

A549 細胞中 siSphK1 轉染減少 fibronectin 表達，增強 E-cadherin 表達，并降低 ERK1/2 活化；而 SphK1過表達降低E-cadherin表達，增強fibronectin表達，并誘導ERK1/2活化（P＜0.05），見圖3。

4 ERK1/2 參與調節(jié) E-cadherin 和 fibronectin 表達及細胞侵襲和遷移

20 μmol/L U0126顯著抑制了SphK1過表達誘導的 ERK1/2 磷酸化水平；與 DMSO 處理的 SphK1 組相比，U0126處理后fibronectin 表達顯著下調，而E-cadherin 表達顯著上調，見圖4A。此外，抑制ERK1/2 信號通路顯著抑制了A549 細胞的侵襲和遷移（P＜0.05），見圖4B、C。

討 論

作為SphK 家族的一個重要成員，SphK1 在細胞間和細胞內信號傳導的調節(jié)中起著重要作用，在不同的腫瘤中均觀察到SphK1 的過表達［5-7］。據報道，NSCLC 組織中SphK1 的表達顯著增加，并與NSCLC患者的腫瘤進展和較差的存活率相關［11］。與之一致，本研究亦觀察到SphK1 在NSCLC 組織中高表達且在晚期TNM 階段表達更高，表明SphK1 在NSCLC進展中起著重要作用。

SphK1 在腫瘤的多種細胞過程中起調節(jié)作用，包括調節(jié)乳腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌細胞的增殖［7-8］。進一步研究表明，SphK1促進結腸癌、肝癌和卵巢癌細胞的侵襲和遷移［5，12］，提示 Sphk1 可能參與腫瘤轉移。本研究觀察了SphK1在NSCLC 細胞中的作用，結果顯示過表達SphK1 可增強NSCLC 細胞的侵襲和遷移，而敲減SphK1則顯著抑制了侵襲和遷移，這也進一步證實SphK1 是NSCLC 侵襲和轉移的關鍵調節(jié)因子之一。

EMT 反映了腫瘤的侵襲和轉移表型，并促進了包括肺癌在內的多種腫瘤的遠處轉移［13-14］。也有研究顯示SphK1 在結腸癌HTC116 細胞EMT 過程中發(fā)揮重要作用［14］。我們在肺癌細胞中也觀察到類似的變化，SphK1過表達抑制了肺癌細胞的遷移，上皮細胞連接蛋白E-cadherin 減少，間充質標志物fibronectin 增加。ERK1/2 作為預防和治療與EMT 相關的轉移性腫瘤的潛在靶標已受到廣泛關注［15］，該通路也是導致腫瘤發(fā)生過程中細胞增殖、轉移和EMT 的途徑之一［13］。許多類型的癌癥（包括肺癌）中的p-ERK1/2 水 平 升 高［16-17］。 而 SphK1對肺癌細胞中ERK1/2 信號通路的影響尚不明確。本研究結果顯示，SphK1 的過表達刺激了ERK1/2 信號通路的激活，而敲減SphK1減弱了ERK1/2 信號通路的激活，表明SphK1 影響NSCLC 細胞中ERK1/2 信號通路途徑的激活。ERK1/2 通路在肺癌組織中經常失調，并且在腫瘤的侵襲和轉移中起關鍵作用［18］。本研究還發(fā)現，抑制ERK1/2途徑減弱了SphK1介導的EMT 相關基因表達變化及細胞的侵襲和遷移，表明SphK1可能通過ERK1/2 途徑調節(jié)NSCLC 細胞的EMT 過程及侵襲和遷移，靶向ERK 途徑的藥物或許可用于治療過表達SphK1的肺癌。

Figure 3.SphK1 was involved in the regulation of p-ERK1/2，E-cadherin and fibronectin protein levels.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.05 vs siNC group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.圖3 SphK1參與調節(jié)p-ERK1/2、E-cadherin和fibronectin蛋白水平

Figure 4.ERK1/2 was involved in the regulation of E-cadherin/fibronectin expression（A），cell migration（B）and cell invasion（C）.The A549 cells were pretreated with U0126（20 μmol/L）or DMSO for 30 min.Scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC+DSMO group；#P＜0.05 vs NC+U0126 group.圖4 ERK1/2參與調節(jié)E-cadherin和fibronectin表達及細胞遷移和侵襲

綜上所述，SphK1 可能通過ERK1/2 途徑調節(jié)NSCLC 細胞中的EMT 過程，并促進NSCLC 細胞的侵襲和遷移。