Rab11-FIP4通過IGF1R調控結直腸癌細胞遷移和侵襲*

陳 露， 潘純純， 鄭 波， 裴繼華， 盧光榮， 薛戰(zhàn)雄

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內科，浙江溫州325000）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上常見的腫瘤之一［1-2］。2015 年中國有 37.63 萬新診斷為CRC 的患者和19.1 萬死于結直腸癌的病例［3］。目前結直腸癌的診斷技術和臨床治療效果有所提高，但由于復發(fā)和轉移的風險，結直腸癌患者，尤其是晚期結直腸癌患者的預后仍然很差［4］。據(jù)統(tǒng)計約有50%的結直腸癌患者發(fā)生遠處轉移，特別是肝轉移［5］，而引起結直腸癌進展和轉移的確切分子機制尚未明確。

Rab11 家族相互作用蛋白4（Rab11-family interacting protein 4，Rab11-FIP4）是在人類基因組計劃中被首先發(fā)現(xiàn)的，當時被稱為KIAA1821基因［6］。Rab11-FIP4 的C 末端含有一個 Rab11 結合區(qū)（Rab11 binding domain，RBD），選擇性地與 Rab11 的GTP 結合形式相互作用［5］，其 N 末端含有 EF 手鈣結合基序［7］。Rab11-FIP4 定位于細胞內的再循環(huán)內體，作為Rab11 的下游調節(jié)劑調節(jié)囊泡運輸［8-9］。研究表明，肝細胞癌中Rab11-FIP4 通過激活雷帕霉素/AKT1 底物 1 發(fā)揮促轉移的作用［10］。然而，Rab11-FIP4在結直腸癌中的潛在影響尚不明確。本研究將探討Rab11-FIP4 在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用、臨床意義及相關機制，探究Rab11-FIP4 在臨床治療結直腸癌中的可能性。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 臨床樣本 收集溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院2009 年 1 月～2015 年 10 月期間的 100 例結直腸癌患者的組織樣本，并同時取得50 例配對的癌旁正常組織。結直腸癌的病理學診斷由不知情的病理學醫(yī)生確認。本研究經溫州醫(yī)科大學倫理委員會審核批準，所有參與此研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株 人結直腸癌細胞株（LoVo 和HCT116）獲自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 免疫組織化學染色 構建組織芯片，根據(jù)既往研究進行免疫組織化學染色和免疫染色評分［11］。將組織芯片脫蠟，再水化，用2%正常山羊血清（Thermo Fisher Scientific 于）37℃封閉90 min。在免疫組化分析中使用Vectastain Elite ABC 試劑盒（Vector Laboratories）。將組織切片（5 μm）與Rab11-FIP4；1∶50；Sigma-Aldrich）和缺氧誘導因子 1α（hypoxia-indacible factor 1α，HIF-1α）（1∶100；Thermo Fisher Scientific）I 抗在4℃條件下孵育過夜。使用DAB 過氧化物酶底物試劑盒（Agilent Technologies）在37℃下使相應的Ⅱ抗顯色20 min。用蘇木精和伊紅在37℃下使細胞染色90 s。顯微鏡（×400）觀察組織切片。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics）計算A，并且從每個樣本3個圖像中計算平均A。

2.2 細胞培養(yǎng)和缺氧條件 將LoVo 和HCT116 細胞在含有10%胎牛血清（Gibco）、青霉素（1×104U/L；Thermo Fisher Scientific）和鏈霉素（10 mg/L；GE Healthcare Life Sciences）的DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）中培養(yǎng)。兩種細胞株都在37℃、94%N2、5%CO2和1%O2構成的缺氧條件下培養(yǎng)48 h。

2.3 Rab11-FIP4 過表達慢病毒的構建 將Rab11-FIP4 開放閱讀框序列（NM_032932.5）克隆到pWPXL 載體（Addgene）中，構建pWPXL-Rab11-FIP4重組質粒。使用LipofectamineTM2000 轉染試劑（Thermo Fisher Scientific）將 pWPXL-Rab11-FIP4、psPAX2（包裝質粒）和pMD2.G（包膜質粒）共轉染293T 細胞。轉染48 h 后收獲慢病毒，在聚凝胺（6 mg/L；Sigma-Aldrich）存在的條件下，以MOI=10 用慢病毒感染結直腸癌細胞。

2.4 RT-qPCR 使用 TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific）從細胞和組織中提取總RNA，并使用PrimeScriptTMRT 試劑盒（TaKaRa）在50 μL 總體積中進行逆轉錄。逆轉錄反應在37℃下進行15 min，然后在85℃下進行5 s。cDNA 在-20℃下保存?zhèn)溆?。隨后使用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）進行qPCR。PCR 條件:95℃ 15 s；95℃ 5 s，60℃ 40 s，35 個循環(huán)。使用β-actin 作為內參照，并通過2-ΔΔCt法（ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCtβ-actin）計算相對表達水平［12］。Rab11-FIP4 的上游引物序列為5'-CTGCTCTCAATGCTGCAAGA-3'，下游引物序列為5'-TCGCAAGAGTCAATGCTGTC-3'；IGF1R 的上游引物序列為5'-TCGACATCCGCAACGACTATC-3'，下游引物序列為5'-CCAGGGCGTAGTTGTAGAAGAG-3'；β-actin 的上游引物序列為5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3'，下游引物序列為5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'。

2.5 Western blot 實驗 根據(jù)之前的研究進行Western blot［11］。裂解腫瘤細胞和組織，除去細胞碎片。用補充有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的TPER 組織蛋白提取試劑（Pierce）來制備細胞或組織裂解物。Western blot實驗中IGF1R 抑制劑處理的條件 為 HCT116-Rab11-FIP4 細 胞 用 NVP-AEW541（5 μmol/L）處理12 h。用二辛可寧試驗試劑盒（Pierce）測定蛋白質濃度。在10%SDS-PAGE 上分離60～80 μg 總蛋白質/樣品，并將其固定在硝酸纖維素膜上。然后用5%脫脂牛奶在室溫下封閉硝酸纖維素膜約2 h。加入 I 抗［Rab11-FIP4（1∶1 000），Rab11（1∶1 000），HIF-1α（1∶1 000），IGF1R（1∶1 000），p-ERK1/2（1∶1 000），ERK1/2（1∶1 500），p-AKT（1∶1 000），AKT（1∶1 500），β-actin（1∶3 000），均購自Santa Cruz］在4℃下孵育過夜。隨后與辣根過氧化物酶綴合的II 抗（1∶5 000）在室溫下溫育1 h。使用增強的化學發(fā)光試劑顯色條帶。Image Lab 4.1 軟件（Bio-Rad）用于條帶的圖像采集和光密度分析。

2.6 免疫共沉淀 使用Pierce?Co-IP 試劑盒進行免疫共沉淀分析。將抗Rab11-FIP4 的抗體（1∶50；Novus Biologicals）在室溫下固定在氨基連接臂加偶聯(lián)樹脂。使用對照樹脂來防止非特異性結合，隨后將細胞裂解物加入到含有固定的抗體樹脂的離心柱中，并在4℃孵育過夜。然后使用溫和的洗脫緩沖液使相互作用的蛋白與固定的抗體分離。

2.7 雙螢光素酶報告基因檢測 使用雙螢光素酶報告基因測定法（Promega）檢測螢光素酶活性。將HCT116 細胞鋪在96 孔板中。在HCT116 細胞中，用pCMV-HIF1α（每孔200 ng）或pCMV-載體（每孔200 ng）和pRL-TK（每孔6 ng；海腎螢光素酶）共轉染截短的Rab11-FIP4啟動子的pGL3構建體（螢火蟲螢光素酶）。將pGL3的空質粒定義為pGL3-Basic。pGL3和pRL-TK 載體購自Promega。pCMV 載體購自Addgene。轉染后6 h 用PBS 洗滌平板并用新鮮培養(yǎng)基替換。然后使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)測量轉染48 h 后的螢火蟲和海腎螢光素酶活性。將螢火蟲螢光素酶活性標準化為海腎螢光素酶活性。

2.8 細胞活力測定 采用CCK-8 試劑（Dojindo Molecular Technologies）檢測結直腸癌細胞的活力。將細胞（每孔4×103）接種于96孔培養(yǎng)板中，然后在37℃培養(yǎng)0、24、48和72 h后加入CCK-8試劑，最終使用酶標儀（BioTek Instruments）測定450 nm吸光度（A）值。

2.9 平板集落形成實驗 將LoVo 和HCT116 細胞（每孔800 個）接種到單獨的6 孔板中，共孵育8 d，并且培養(yǎng)液每2 d更換1次。此后，細胞用PBS洗滌，在37℃下用4%多聚甲醛固定15 min，并用1%結晶紫溶液染色5 min。使用光學顯微鏡（×400）計數(shù)大于50個細胞的集落。

2.10 細胞遷移和侵襲實驗 （1）遷移實驗:將Transwell 小室（8 μm；BD Biosciences）置于 24 孔板中。將結直腸癌細胞重懸于無血清培養(yǎng)液中，以每孔2×104個的密度加入Transwell小室上室內，向下室加入含有15%FBS 的培養(yǎng)液。溫育20 h后，用1%結晶紫染色遷移的結直腸癌細胞5 min，在200 倍CKX41 光學顯微鏡下計數(shù)遷移細胞。每組實驗設3個復孔，重復3 次計數(shù)遷移細胞的平均數(shù)。（2）侵襲實驗:將結直腸癌細胞重懸于無血清培養(yǎng)液中，以每孔4×104個的密度加入預先鋪好的Matrigel（BD Biosciences）的Transwell 小室上室內，向下室加入含有15% FBS 的培養(yǎng)液。溫育36 h 后，將侵襲的細胞染色，成像并計數(shù)，每組實驗設3 個復孔，重復3 次，計數(shù)侵襲細胞的平均數(shù)。遷移和侵襲實驗中抑制劑處理組條件為:分別用 ERK 抑制劑U0126（5 μmol/L）或 AKT 抑 制 劑 LY294002（10 μmol/L）預 處 理HCT116-Rab11-FIP4細胞6 h。

2.11 人類磷酸激酶陣列測定 依照說明書（R&D Systems）將 HCT116-載體或 HCT116-Rab11-FIP4 細胞用于磷酸激酶陣列測定中。簡言之，將細胞裂解物（800 μg）與陣列緩沖液混合，在4℃下與預封閉陣列膜孵育過夜。清洗膜后與I 抗在37℃下孵育2 h，然后洗滌（采用洗滌緩沖液洗滌5 min、3 次），再與II抗在37℃下孵育30 min，再次洗滌膜并進行化學發(fā)光檢測。

3 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 5.0 軟件分析本研究中的所有數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，然后用Tukey檢驗。總生存時間由Kaplan-Meier法確定，并用對數(shù)秩檢驗進行比較。Rab11-FIP4 與HIF-1α 的相關性采用Pearson 相關分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Rab11-FIP4 在結直腸癌組織中表達上調，且其高表達與結直腸癌患者的預后不良有關

免疫組化分析顯示，在結直腸癌的臨床樣本中，大多數(shù)Rab11-FIP4分布于結直腸癌細胞的細胞質和膜中，見圖1A；結直腸癌組織中Rab11-FIP4 的表達水平顯著高于相應的非癌組織（P＜0.01），見圖1B、C。RT-qPCR 分析結果類似，見圖1D。此外，根據(jù)免疫組化染色評分結果將結直腸癌患者分為Rab11-FIP4 高表達組（n=61）和 Rab11-FIP4 低表達組（n=39）。Kaplan-Meier 生存分析顯示，與 Rab11-FIP4 低表達組相比，Rab11-FIP4 高表達組的總生存時間縮短（P＜0.05），復發(fā)率升高（P＜0.05），見圖1E、F。本研究所包含的結直腸癌患者的臨床和病理特征見表1。

Figure 1.High expression of Rab11-FIP4 predicted poor prognosis in patients with colorectal cancer（CRC）.A:representative immunohistochemistry（IHC）images of Rab11-FIP4 expression.B:IA values of IHC analysis for Rab11-FIP4 expression in 40 paired samples from CRC patients.Mean±SD. n=40.**P＜0.01 vs non-tumorous（NT）group.C:the similar trend was observed in fold change of the Rab11-FIP4 A values in 40 paired samples from CRC patients.D:50 paires of CRC tissues and correspongding NT tissues detected by RT-qPCR revealed that the mRNA level of Rab11-FIP4 in CRC group was increased compared with NT group.β-actin was used as loading control.Mean±SD. n=50.**P＜0.01 vs NT group.E，F(xiàn):Kaplan-Meier analysis showed that the patients in high Rab11-FIP4 group（n=61）had reduced overall survival time and a higher tendency for CRC recurrence compared with low Rab11-FIP4 group（n=39）.圖1 Rab11-FIP4高表達預示結直腸癌患者預后不良

2 Rab11-FIP4 的過表達促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

RT-qPCR 和Western blot 分析的結果顯示，在用慢病毒感染的HCT116 和LoVo 細胞中，Rab11-FIP4的 mRNA 和蛋白質水平顯著升高（P＜0.01），見圖2A、B。CCK-8 法和集落形成實驗顯示Rab11-FIP4的過表達提高了結直腸癌細胞的活力（P＜0.05）和集落形成數(shù)量（P＜0.05），見圖2C、D。Transwell 實驗顯示Rab11-FIP4高表達顯著增加了HCT116和LoVo細胞的遷移和侵襲能力（P＜0.05），見圖2E、F。

3 Rab11-FIP4 過表達通過 IGF1R 增加 ERK1/2 和AKT的磷酸化，促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲

Western blot 分 析 顯 示 ，HCT116 細 胞 過 表 達Rab11-FIP4 后，IGF1R 蛋白水平上調，見圖3A。然而，HCT116 細胞中Rab11-FIP4 的過表達未引起IGF1R mRNA 水平的相應增加（P＞0.05），見圖3B。使用Rab11-FIP4 過表達的HCT116 細胞和相應的對照細胞進行免疫共沉淀測定顯示，Rab11-FIP4 與Rab11 和 IGF1R 形成復合物，并且 Rab11-FIP4 的過表達增加了HCT116 細胞中該復合物的形成，見圖3C。此外，采用人類磷酸激酶陣列測定顯示在HCT116 細 胞 中 Rab11-FIP4 過 表 達 后 ，ERK1/2 和AKT 的磷酸化水平增加（P＜0.05），見圖3D；Western blot 實驗也證實了這一結果但用IGF1R 抑制劑處理HCT116 細胞后，p-ERK1/2 和 p-AKT 水平降低，見圖3E。再分別用ERK1/2 和AKT 抑制劑處理穩(wěn)定過表達Rab11-FIP4 的HCT116 細胞后顯示，與用ERK1/2和AKT 未處理的細胞相比，抑制劑處理的結直腸癌細胞遷移和侵襲能力顯著降低（P＜0.05），見圖3F、G。

表1 結直腸癌患者臨床和病理特征Table 1.Clinical and pathological characteristics of colorectal cancer patients

4 缺氧通過誘導結直腸癌細胞中HIF-1α 高表達從而引起Rab11-FIP4的表達上調

Western blot結果表明，與相應的非癌組織相比，結直腸癌組織中Rab11-FIP4 和HIF-1α 的表達增加，而且HIF-1α 高表達的組織表現(xiàn)出相應的Rab11-FIP4 高表達，見圖4A。對100 例結直腸癌樣品進行Rab11-FIP4 表達免疫組化分析，并結合其組織芯片中HIF-1α 的表達積分光密度值，顯示Rab11-FIP4 與HIF-1α 的表達之間存在顯著的正相關，見圖4B。另外，在缺氧條件下Rab11-FIP4 的mRNA 和蛋白水平顯著增加，見圖4C、D。進一步使用雙螢光素酶報告基因測定，顯示Rab11-FIP4 的轉錄起始位點4 個公認的缺氧反應元件（hypoxia response element，HRE）中，HRE3 位點的缺失顯著降低了HIF-1α 誘導的Rab11-FIP4啟動子活性（P＜0.01），見圖4E。

討 論

惡性腫瘤侵襲和遠處轉移（可能是由于癌基因活性上調或抑癌基因活性喪失所致）是包括結直腸癌在內的大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡率升高的主要原因［4］。由于出現(xiàn)遠處轉移，接受手術切除或化療的結直腸癌患者的生存率仍然較低［5］。到目前為止，導致結直腸癌轉移的關鍵因素尚未確定。本研究顯示，與相應的非癌組織相比，結直腸癌組織中Rab11-FIP4 的表達水平顯著升高，并且Rab11-FIP4 高表達導致結直腸癌患者總生存時間和復發(fā)時間縮短；Rab11-FIP4 的高表達促進了結直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移。因此，該研究提示了Rab11-FIP4可能是一個促使結直腸癌進展的癌基因，并且Rab11-FIP4 有可能成為預測結直腸癌患者預后的生物標志物。

Figure 2.Overexpression of Rab11-FIP4 promoted proliferation，migration and invasion of colorectal cancer（CRC）cells.RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect lentiviral-mediated Rab11-FIP4 expression levels in HCT116 and LoVo cells.CCK-8 assay（C）and colony formation assay（D）revealed that up-regulation of Rab11-FIP4 expression enhanced the proliferation ability of CRC cells.Transwell assays showed that Rab11-FIP4 overexpression promoted migration（E）and invasion（F）of CRC cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P ＜0.01 vs vector group.圖2 Rab11-FIP4的過表達促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

Rab11 小 G 蛋白（Rab11a、Rab11b 和 Rab25）是Ras 超家族的成員，具有高度的序列同一性，是受體和黏附蛋白表面表達的調節(jié)因子。大量的研究表明Rab11可以調節(jié)多種受體和黏附蛋白的轉運，包括視紫紅質、表皮生長因子受體、Toll樣受體4、α5β1整合素、E-鈣黏蛋白和 N-鈣黏蛋白［13］。Rab11 直接與肌球蛋白Vb（myosin Vb，MyoVb）球狀尾部結構域結合，而MyoVb 的C 端與Rab11 相互作用蛋白家族（Rab11 family interacting proteins，Rab11-FIPs）結合。Rab11-FIPs 包 括 Rip11、Rab11-FIP1、Rab11-FIP2、Rab11-FIP3、RCP 和 Rab11-FIP4，在之前已經被證明是多個Rab 和ADP-核糖基化因子GTPases 的調節(jié)因子［8］。Lall 等［14］認為，所有的 Rab11-FIPs 都與 Rab14和I類FIPs（RCP、FIP2 和Rip11）相互作用，而不與II類FIPs（FIP3 和FIP4）相互作用。有研究證明FIP2和FIP3 的RBD 與Rab11 可以形成復合物，從而組成具有兩兩對稱的異四聚體結構［15-17］。本研究顯示Rab11-FIP4 的表達上調顯著增加了IGF1R 的蛋白水平，但不影響IGF1R mRNA 水平。該研究證明了Rab11-FIP4 可以與 Rab11 和 IGF1R 形成復合物，并且Rab11-FIP4 在HCT116 細胞中高表達增加了該復合物的形成。然而這一過程的確切生物、生理和細胞機制尚未明確。

分子和臨床證據(jù)表明胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）/IGF1R 系統(tǒng)（包括 IGF，IGF1R和IGF結合蛋白）與實體腫瘤的增殖、分化、遷移，侵襲和血管生成有關。IGF1R 通常在結直腸癌組織中過度表達和激活，并參與結直腸癌的進展和轉移［18］。通過與其配體 IGF1 或 IGF2 結合，IGF1R 的內在酪氨酸激酶活性被激活，導致其自磷酸化，并隨后激活AKT 和絲裂原活化蛋白激酶途徑［19-20］。有研究報道在肝癌細胞中干擾IGF1R 表達，可引起PI3K/AKT 和 MAPK 信號通路中 AKT 和 ERK1/2 的磷酸化水平顯著降低［21］。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)Rab11-FIP4 通過 IGF1R 調節(jié) ERK1/2 和 AKT 信號通路的磷酸化從而促進結直腸癌的遷移和侵襲過程。

Figure 3.Overexpression of Rab11-FIP4 promoted migration and invasion of colorectal cancer cells through IGF1R-mediated phosphorylation of ERK1/2 and AKT.A:Rab11-FIP4 overexpression in HCT116 cells up-regulated the protein level of IGF1R；B:RT-qPCR analysis showed that Rab11-FIP4 overexpression had no effect on the mRNA level of IGF1R；C:coimmunoprecipitation results demonstrated that Rab11-FIP4 interacted with Rab11 and IGF1R；D:Rab11-FIP4 overexpression increased the phosphorylation of ERK1/2 and AKT（detected by phosphokinase assay，fold change ≥2.0）；E:the protein levels of p-ERK1/2 and p-AKT were reduced following IGF1R inhibitor treament in HCT116-Rab11-FIP4 cells；F，G:HCT116-Rab11-FIP4 cells treated with either ERK inhibitor or AKT inhibitor had significantly reduced migration and invasion abilities.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Rab11-FIP4 group.圖3 Rab11-FIP4的過表達通過IGF1R介導ERK1/2和AKT的磷酸化促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲

實體腫瘤的快速生長造成了缺氧的微環(huán)境，促進了腫瘤的血管生成和轉移。HIF-1α通過缺氧微環(huán)境穩(wěn)定并誘導一系列參與結直腸癌轉移的靶基因表達［22］。研究表明，在肝細胞癌中Rab11-FIP4是 HIF-1α 的直接靶基因［10］。本研究顯示 Rab11-FIP4 和HIF-1α 在結直腸癌組織中的表達存在顯著的正相關，在缺氧條件下，Rab11-FIP4 和 HIF-1α 的表達水平顯著增加。本研究還證實HIF-1α 可通過直接結合啟動子上的HRE 位點從而誘導Rab11-FIP4 轉錄。這些結果提示在結直腸癌細胞中Rab11-FIP4也是HIF-1α 的靶基因。我們推測在缺氧微環(huán)境下，HIF-1α 通過 Rab11-FIP4/IGF1R/ERK1/2 及 AKT 信號通路促進結直腸癌發(fā)生發(fā)展。因此，本項工作的結果為結直腸癌發(fā)生發(fā)展中缺氧介導的信號轉導機制及Rab11-FIP4 可能是結直腸癌治療的潛在靶標提供了參考資料。