白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)miR-223-3p/NLRP3通路發(fā)揮對(duì)幼年大鼠腦膜炎模型皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用*

高 蒙， 黃 娟

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，重慶400016）

新生兒細(xì)菌性腦膜炎（bacterial meningitis，BM）是新生兒期嚴(yán)重的急性感染性疾病，其發(fā)病率約占新生兒總數(shù)的0.2%～1.0%，在早產(chǎn)兒中則高達(dá)3%［1］。B 族溶血性鏈球菌（group B hemolyticStreptococcus，GBS）是新生兒腦膜炎的常見致病菌之一，GBS 感染引起的細(xì)菌性腦膜炎可導(dǎo)致約10%的患兒死亡，25%～35%的患兒留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［2］。細(xì)菌性腦膜炎的不良預(yù)后與炎癥因子釋放導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷密切相關(guān)［3］。神經(jīng)元損傷的表現(xiàn)形式有凋亡、壞死、焦亡等［4-6］。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）又稱為細(xì)胞炎性壞死，它是近年來發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡方式，其特征為依賴于胱天蛋白酶1（caspase-1），并伴有白細(xì)胞介素 1β（interlukin-1β，IL-1β）和 IL-18 等炎癥因子的釋放［7］。有研究顯示細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)［8］。目前，關(guān)于在新生兒細(xì)菌性腦膜炎模型中是否發(fā)生神經(jīng)元焦亡的研究較少，針對(duì)此模型中神經(jīng)元焦亡的作用，以及抑制焦亡對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響等問題，仍有待探討。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一類存在于虎杖、葡萄、花生、桑葚等多種植物內(nèi)的多酚類化合物［9］。目前有文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇具有廣泛的生物和藥理活性，對(duì)心血管、呼吸、神經(jīng)等多個(gè)系統(tǒng)中的器官和細(xì)胞發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等重要作用［10-12］。有研究顯示，在肺炎鏈球菌性大鼠腦膜炎模型中白藜蘆醇可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，在海馬區(qū)發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用［13-14］。但白藜蘆醇對(duì)腦膜炎模型中皮質(zhì)功能區(qū)的神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用則未見報(bào)道。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，可通過與靶基因mRNA 互補(bǔ)結(jié)合而抑制靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等功能［15-16］。有文獻(xiàn)顯示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中白藜蘆醇可通過調(diào)控miRNA 的表達(dá)水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［13，17］。在細(xì)菌性腦膜炎模型中，白藜蘆醇能否通過調(diào)控miRNA 的表達(dá)水平發(fā)揮抗神經(jīng)元焦亡和凋亡的作用值得研究。在本研究中，我們利用GBS 建立幼年大鼠腦膜炎模型，并針對(duì)此模型中白藜蘆醇是否通過調(diào)控miR-223-3p發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了研究和探討。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3周齡健康SD 大鼠64只（其中術(shù)中死亡4只，實(shí)驗(yàn)中予以排除），雌雄不限，體重約50 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（渝）2018-0003。大鼠飼養(yǎng)于安靜，通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中，自由攝食和飲水，室溫控制在（25±0.5）℃，相對(duì)濕度60%～70%，12 h 晝夜節(jié)律。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

為明確白藜蘆醇對(duì)大鼠腦膜炎損傷模型的最佳治療劑量，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組，模型（BM）組，以及白藜蘆醇低劑量（0.03 mg/kg）、中劑量（0.06 mg/kg）和高劑量（0.12 mg/kg）組；為確定最佳治療劑量的白藜蘆醇對(duì)大鼠腦膜炎模型神經(jīng)功能、腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及miR-223-3p表達(dá)的影響，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為sham 組、BM 組和白藜蘆醇治療（BM+Res）組；為明確miR-223-3p 與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）之間的相互作用，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為BM+Res+antagomir 對(duì)照（BM+Res+antagomir control）組和 BM+Res+miR-223-3p antagomir組。

2 主要儀器與試劑

腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo）；熒光定量PCR 儀、蛋白電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；熒光顯微鏡（Olympus）。白藜蘆醇（Sigma）；miR-223-3p antagomir和antagomir陰性對(duì)照（RiboBio）；兔抗NLRP3 多克隆抗體、鼠抗NeuN 單克隆抗體、兔抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、兔抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）單克隆抗體、兔抗IL-1β 多克隆抗體及兔抗IL-18 多克隆抗體（Abcam）；兔抗cleaved caspase-1（CC-1）多克隆抗體（Novus Biologicals）；兔抗β-actin單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及HE染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；HRP AffiniPure goat anti-rabbit IgG（H+L）和HRP AffiniPure goat anti-mouse IgG（H+L）購自 EarthOx Life Science；RNAIso Plus 試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit 和 SYBR Green 試劑（TaKaRa）；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 方法

3.1 細(xì)菌培養(yǎng) GBS 由重慶市九龍坡醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌培養(yǎng)室提供。將細(xì)菌接種到血瓊脂糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～24 h（37℃，5% CO2），生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，用生理鹽水清洗2 次，紫外分光光度儀檢測(cè)菌液的濁度，稀釋菌液至1×108CFU/L。

3.2 BM 模型的制備 用1%的戊巴比妥鈉（10 mL/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，將動(dòng)物俯臥位固定于腦立體定位儀，采用微量注射器從小腦延髓池穿刺進(jìn)針，回抽50 μL腦脊液舍去，模型組注入B族溶血性鏈球菌懸液50 μL，假手術(shù)組采用同樣方法注入等量生理鹽水［1］。

3.3 白藜蘆醇給藥 用1%的戊巴比妥鈉（10 mL/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，在接種B 族溶血性鏈球菌后1 h，采用移液槍將白藜蘆醇（DMSO 溶液稀釋，每只5 μL）緩慢滴加入雙側(cè)鼻腔中，5 min 之內(nèi)滴注完畢［14］。

3.4 側(cè)腦室注射 用1%的戊巴比妥鈉（10 mL/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，將其俯臥位固定于腦立體定位儀；備皮，消毒后沿顱腦中線作一個(gè)縱向切口，在前囟前方1.0 mm，右側(cè)1.5 mm 處鉆一個(gè)深度2.5 mm 的孔；在大鼠BM 模型建立前48 h，利用微量注射器將 miR-223-3p antagomir（1 nmol/L，無菌生理鹽水稀釋，每只5 μL）或antagomir 陰性對(duì)照（1 nmol/L，無菌生理鹽水稀釋，每只5 μL）緩慢注入同側(cè)側(cè)腦室中。5 min 之內(nèi)注射完畢后，將針停留10 min 以防止泄露，而后將針緩慢取出。骨蠟封閉鉆孔，縫合切口。

3.5 Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 參照Loeffler 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分方法［18］，在細(xì)菌接種48 h 后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:抓住背部時(shí)正常活動(dòng)，在5 s 內(nèi)翻身成功為5 分；自主活動(dòng)減少，在5 s 能翻身為4 分；翻身可以成功，但時(shí)間超過5 s 為3 分；不能翻身為2分；不能運(yùn)動(dòng)為1分；死亡為0分。

3.6 腦組織處理及HE 染色 在術(shù)后48 h，每組隨機(jī)取6 只大鼠，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h，梯度（10%、20%、30%）蔗糖脫水至沉底，OCT包埋，在冰凍切片機(jī)中行連續(xù)冠狀切片（10 μm），-20℃保存待用。取各組切片進(jìn)行HE常規(guī)染色。

3.7 免疫熒光檢測(cè) 切片37 ℃復(fù)溫1 h，用0.01 mol/L PBST 洗3 次，4%馬血清37 ℃封閉1 h，滴加 I抗［NeuN（1∶200）、IL-1β（1∶200）、IL-18（1∶100）、GFAP（1∶200）和 Iba1（1∶100）］4 ℃孵育過夜。37 ℃復(fù)溫1 h，PBST 洗 3 次，加入相應(yīng)的熒光II 抗37 ℃避光孵育 1 h，PBST 洗 3 次，DAPI 孵育 5 min，PBST 洗 3次，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，并用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析。若檢測(cè)神經(jīng)元凋亡則需在封片前進(jìn)行TUNEL染色。

3.8 TUNEL 染色 將切片用 PBS 清洗 2 次，0.5%Triton X-100室溫孵育5 min，加入50 μL TUNEL檢測(cè)液（TdT 酶∶熒光標(biāo)記液=1∶9）于37℃避光孵育60 min，PBS 洗3 次，用抗熒光淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，用ImageJ 圖像分析軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。

3.9 Western blot 檢測(cè)NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白的水平 在術(shù)后48 h，每組隨機(jī)取6只大鼠通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉后，左心室灌注生理鹽水，迅速斷頭取腦，分離保留腦皮質(zhì)，-80 ℃保存待用。用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液于冰上充分勻漿，14 000 r/min 離心20 min 后收集上清液，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 分離蛋白，恒流電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，加入抗β-actin（1∶5 000）、NLRP3（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和IL-18（1∶1 000）等 I 抗 4℃孵育過夜。PBST 洗 3 次，加入相應(yīng)II 抗（1∶10 000）于37℃孵育1 h，ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用Quantity One軟件測(cè)量各條帶灰度值，并將目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶灰度值的比值做統(tǒng)計(jì)分析。

3.10 RT-qPCR檢測(cè)腦組織中miR-223-3p的表達(dá)取凍存于-80℃的各組腦組織，根據(jù)Trizol 法，加入RNAiso Plus 后冰上充分勻漿，14 000 r/min 離心5 min收集上清液，依次加入氯仿和異丙醇后分別離心10 min，加入75%乙醇后保留沉淀干燥處理，溶于DEPC水中。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μL cDNA 進(jìn)行RT-qPCR，按照說明書加入引物，序列見表1。反應(yīng)條件為:95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct），利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.11 生物信息學(xué)查詢 利用在線miRNA 預(yù)測(cè)軟件 TargetScan（http://www.targetscan.org）查詢 miR-223-3p與NLRP3 mRNA中互補(bǔ)的核苷酸序列。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠腦組織的病理改變

假手術(shù)組大鼠腦膜結(jié)構(gòu)正常，腦內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則，無血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；腦膜炎模型組大鼠腦膜增厚，腦內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，蛛網(wǎng)膜下腔擴(kuò)張，充血明顯并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

2 不同劑量白藜蘆醇干預(yù)對(duì)大鼠皮質(zhì)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量的影響

與假手術(shù)對(duì)照組比較，腦膜炎模型組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)TUNEL 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量白藜蘆醇干預(yù)均可使大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)TUNEL 陽性神經(jīng)元明顯減少（P＜0.05）；與0.03 mg/kg 和0.12 mg/kg 白藜蘆醇治療組相比，0.06 mg/kg 白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)TUNEL 陽性神經(jīng)元減少最為明顯，因此我們選擇0.06 mg/kg白藜蘆醇治療組作為最佳劑量組行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，見圖2。

Figure 1.Representative images of HE staining in sham group and BM group.The black arrows indicate the meninges.圖1 各組大鼠腦組織HE染色

3 白藜蘆醇改善神經(jīng)功能

與假手術(shù)對(duì)照組比較，腦膜炎模型組大鼠的Loeffler 神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；與腦膜炎模型組比較，白藜蘆醇治療組的Loeffler 神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加（P＜0.05），見圖3。

4 白藜蘆醇下調(diào)腦膜炎皮質(zhì)組織中NLRP3、CC-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，在腦膜炎模型組中，大鼠腦皮質(zhì)中IL-1β 和IL-18 分別與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN 共表達(dá)，見圖4A、B。與假手術(shù)對(duì)照組比較，腦膜炎模型組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)IL-1β 和IL-18熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)IL-1β 和IL-18 熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05），見圖4C、D。

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，腦膜炎模型組腦皮質(zhì)內(nèi)NLRP3、CC-1、IL-1β 和IL-18 蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組 NLRP3、CC-1、IL-1β 和IL-18蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯減少（P＜0.05），見圖4E。

5 白藜蘆醇減輕腦膜炎模型腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)

假手術(shù)對(duì)照組表達(dá)GFAP 的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，分布稀疏，胞體小，突起細(xì)而少，表達(dá)Iba1的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，突起多而細(xì)，且表達(dá)較少，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞未被激活。與假手術(shù)對(duì)照組比較，腦膜炎模型組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加，胞體顯著增大，突起增長(zhǎng)、增粗和增多，表達(dá)Iba1的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，突起回縮變粗，且表達(dá)增多，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)表達(dá)GFAP 的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體減小，突起減少變細(xì)，表達(dá)Iba1 的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體減小，突起增多、變細(xì)，且表達(dá)減少，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)被抑制，見圖5A、B。

Figure 2.The results of TUNEL staining and NeuN immunofluorescence staining in the brain tissues of the rats in each group.A:the representative images of TUNEL staining and NeuN immunofluorescence staining（the images in the white boxs were the magnifications of the areas indicated by the arrows）；B:the statistical analysis of TUNEL positive neurons in each group.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group；&P＜0.05 vs BM+Res（0.06 mg/kg）group.圖2 各組大鼠腦內(nèi)TUNEL染色及NeuN免疫熒光染色情況的比較

Figure 3.The Loeffler neurological score in each group of the rats.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group.圖3 各組大鼠Loeffler神經(jīng)功能評(píng)分的比較

6 白藜蘆醇上調(diào)腦膜炎模型大鼠皮質(zhì)組織中miR-223-3p的表達(dá)

與假手術(shù)對(duì)照組相比，腦膜炎模型組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)miR-223-3p 的相對(duì)表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)miR-223-3p 相對(duì)表達(dá)量明顯進(jìn)一步增高（P＜0.05），見圖5C。

7 抑制miR-223-3p 減少白藜蘆醇治療的腦膜炎大鼠皮質(zhì)組織中NLRP3蛋白的表達(dá)

利用在線microRNA（miRNA）預(yù)測(cè)軟件TargetScan 查詢發(fā)現(xiàn)miR-223-3p 的部分核苷酸序列與NLRP3 mRNA 3’-URT 的核苷酸序列互補(bǔ)，見圖6A。通過側(cè)腦室注射miR-223-3p antagomir，再用Western blot 檢測(cè)NLRP3 的蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與antagomir 對(duì) 照 組相比，miR-223-3p antagomir 處 理 組NLRP3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），見圖6B。

討 論

炎癥反應(yīng)是組織受到病原體感染、缺血缺氧和外傷等刺激后發(fā)生的病理生理反應(yīng)。一般情況下，炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)外界刺激和損傷的正常應(yīng)答，發(fā)揮清除有害物質(zhì)和促進(jìn)組織修復(fù)再生的功能；但過度的炎癥反應(yīng)則對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷［19］。Li 等［20］的研究結(jié)果顯示，在鮑氏不動(dòng)桿菌感染引起的細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生過程中，炎癥小體（inflammasome）活化誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞焦亡即是神經(jīng)細(xì)胞損傷的形式之一。炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)調(diào)控活性炎癥因子產(chǎn)生的多蛋白復(fù)合體，主要由受體蛋白、銜接蛋白和胱天蛋白酶1前體（pro-caspase-1）三部分共同組成［21］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotidebinding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptors，NLRs）蛋白家族是受體蛋白中的一類，包括 NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12、NLRC4 和 NLRC5 等［22］，其中 NLRP3 炎癥小體被研究得最為深入、廣泛，它通過NLRP3識(shí)別感染和氧化應(yīng)激等刺激，招募和激活蛋白水解酶caspase-1，進(jìn)而剪切 IL-1β 和 IL-18 的前體（pro-IL-1β 和 pro-IL-18），產(chǎn)生相應(yīng)的炎癥因子，啟動(dòng)細(xì)胞的炎性死亡，即為焦亡［23-24］。本研究的 Western blot 結(jié)果顯示，在GBS 感染引起的大鼠腦膜炎模型中，NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表達(dá)均較假手術(shù)對(duì)照組增高；免疫熒光結(jié)果顯示，IL-1β 和IL-18 在BM 模型組神經(jīng)元中的熒光強(qiáng)度增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。這些結(jié)果表明大鼠腦膜炎模型中存在由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞炎性死亡（即焦亡）發(fā)生，與前人的結(jié)果一致。

近年來發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇有抗炎作用，大量文獻(xiàn)表明白藜蘆醇可通過 PI3K/Akt［7］、Src 激酶［25］和 TRAF6/NF-κB［26］等多種信號(hào)途徑在骨關(guān)節(jié)炎［7］、肺損傷［26］和脊髓損傷［26］等疾病中發(fā)揮對(duì)抗過敏反應(yīng)和過度炎癥反應(yīng)的作用。關(guān)于白藜蘆醇用于腦膜炎治療的研究主要集中于它對(duì)海馬區(qū)的抗炎和神經(jīng)元保護(hù)作用［13-14］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療后，動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯提升，腦皮質(zhì)區(qū)炎癥因子IL-1β和IL-18 的釋放和細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)被抑制，表明在腦膜炎的抗感染治療中，白藜蘆醇可作為一個(gè)潛在有效的輔助治療藥物。另外，我們還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可同時(shí)下調(diào)腦膜炎模型中腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和CC-1 的蛋白水平，表明白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)NLRP3 炎癥小體的活性在腦皮質(zhì)區(qū)發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞焦亡的作用。

在腦缺血和帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，白藜蘆醇可通過調(diào)控miRNAs 的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［17，28］。miR-223 是一種存在于斑馬魚、小鼠、家禽、人類等多種物種中的高度保守的miRNA。在哺乳動(dòng)物中，miR-223 廣泛表達(dá)于血液、肝臟、心臟、肺、腦等各種組織中，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝、血細(xì)胞增殖、抑制成骨細(xì)胞分化等作用［28-29］。白藜蘆醇對(duì)miR-223的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谟啄甏笫竽X膜炎模型發(fā)現(xiàn)腦皮質(zhì)中miRNA-223-3p水平較對(duì)照組顯著升高，白藜蘆醇治療后miRNA-223-3p 進(jìn)一步升高，可見白藜蘆醇在細(xì)菌性腦膜炎模型中可發(fā)揮調(diào)節(jié)miRNA-223-3p 表達(dá)水平的作用。另外，我們運(yùn)用在線軟件TargetScan 查詢發(fā)現(xiàn)mi-RNA-223-3p 與NLRP3 mRNA 3'端部分核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合；實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在白藜蘆醇治療的細(xì)菌性腦膜炎動(dòng)物模型中，抑制miR-223-3p 可使NLRP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增加。由此我們認(rèn)為白藜蘆醇可通過上調(diào)miRNA-223-3p 的表達(dá)發(fā)揮抑制NLRP3 炎癥小體的功能，進(jìn)一步抑制下游的caspase-1激活和炎癥因子IL-1β 和IL-18 剪切活化，從而達(dá)到抑制神經(jīng)元焦亡和凋亡的作用。

Figure 4.The expression levels of NLRP3，CC-1，IL-1β and IL-18 in rat brain tissues of each group.A，B:both IL-1β and IL-18 were co-expressed with NeuN in the brain of BM group，respectively（the images in the white boxs were the magnifications of the areas indicated by the arrows）；C，D:the expression of IL-1β and IL-18 detected by immunofluorescence staining in the brain of each group；E:Western blot for determining the protein levels of NLRP3，CC-1，IL-1β and IL-18 in the brain of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group.圖4 各組大鼠腦內(nèi)NLRP3、CC-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平的比較

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在GBS 感染引起的細(xì)菌性腦膜炎模型中神經(jīng)元發(fā)生焦亡和凋亡；白藜蘆醇可能通過調(diào)控miRNA-223/NLRP3 通路減輕神經(jīng)元焦亡和凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

Figure 5.The expression of GFAP and Iba1 was detected by immunofluorescence staining and the expression level of miR-223-3p was detected by RT-qPCR in the rat brain tissues of each group.A，B:the representative images of GFAP and Iba1 expression detected by immunofluorescence staining（scale bar=50 μm）；C:the expression of miR-223-3p.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group.圖5 各組大鼠腦內(nèi)GFAP和Iba1免疫熒光染色情況及miR-223-3p表達(dá)水平的比較