云南小葉種茶樹葉片和莖段愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)

亓 崢， 龐志強， 藍增全*

(1.西南林業(yè)大學生態(tài)與環(huán)境學院，昆明 650224；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續(xù)利用重點試驗室，昆明 650223；3.中國科學院大學，北京 100049)

云南是茶樹的起源地之一，茶樹品種資源豐富，尤其是野生資源。同時，云南也是中國產(chǎn)茶大省，茶葉生產(chǎn)在云南農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要的地位[1-3]。研究表明，相較于云南大葉種茶，云南小葉種茶中胡蘿卜素和葉黃素的含量較高，可制出高香型茶，“十里香”即是典型的云南小葉種茶樹[4]。

隨著茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，選育優(yōu)良茶樹品種的需求也越來越迫切。但茶樹基因具有高度的雜合性，傳統(tǒng)的育種方法在新品種選育中較為困難[5-7]。茶樹組織培養(yǎng)具有培養(yǎng)時間短、繁殖系數(shù)大、后代可保持親本優(yōu)良性狀的優(yōu)點，能夠利用較少的茶樹材料、在短時間內(nèi)產(chǎn)生較多的植株。在實際生產(chǎn)中具有重大的實踐意義，對于優(yōu)良品種快速繁殖、新品種推廣種植、種植資源的保存具有重要的意義[8-10]。

茶樹組培過程中仍存在愈傷組織誘導率低、易褐化、難以分化、基因不能按序表達等問題[11]。目前，茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)不夠成熟，尤其是在無性快繁、保存種質(zhì)資源，建立外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)等方面[12-13]，且前人在茶樹組織培養(yǎng)中多選用胚作為外植體材料，鮮見以茶樹葉片及莖段為外植體誘導愈傷組織的報道。

為此，通過研究不同消毒方法對云南小葉種“十里香”成活率及消毒效果的影響，獲得優(yōu)質(zhì)的無菌試管苗，并以無菌苗的葉片和莖段為外植體,探索不同培養(yǎng)基類型、激素種類及濃度配比對愈傷組織誘導的影響，以期建立穩(wěn)定的愈傷快繁體系，為其他茶樹良種的推廣和繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原材料選用云南小葉種“十里香”，采自云南農(nóng)業(yè)大學教學茶園。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌試管苗萌發(fā)

將茶種剝?nèi)スず头N皮，洗凈，置于超凈工作臺中。通過4%次氯酸鈉溶液和75%酒精組合消毒方式(表1)進行外植體消毒，統(tǒng)計污染率和發(fā)芽率。

表1 不同茶種消毒方法Table 1 Different disinfection methods for tea seeds

1.2.2 茶樹葉片組織培養(yǎng)

將無菌試管茶苗葉片剪去葉邊和葉緣，剪成0.5 cm×0.5 cm方片，在葉片上沿葉脈方向劃出傷口，葉片正面向上，置于培養(yǎng)基上。每瓶培養(yǎng)基中接種5枚葉片，每種培養(yǎng)基處理接種20瓶(下同)，重復3次。培養(yǎng)過程中每5 d觀察1次，統(tǒng)計培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色和生長情況，培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計誘導率。通過正交試驗(MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基與4種激素配比)獲得最適宜誘導茶樹葉片愈傷組織的配方，葉片愈傷組織誘導培養(yǎng)基配方如表2所示。

表2 葉片愈傷組織誘導培養(yǎng)基配方Table 2 Formula of leaf callus induction medium

篩選出茶樹葉片愈傷組織生長較好的培養(yǎng)基作為繼代培養(yǎng)基(表3)，將誘導出的愈傷組織用手術(shù)刀切下，置于葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，繼續(xù)增殖誘導，每5 d觀察1次，培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計葉片愈傷組織增長大小及狀態(tài)。

表3 葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)基配方Table 3 Formula of subculture medium for leaf callus

1.2.3 茶樹莖段組織培養(yǎng)

將無菌苗不帶腋芽的莖段用手術(shù)刀切成0.5 cm的小段，放置于莖段愈傷組織誘導培養(yǎng)基(表4)中，使有切口的兩端接觸培養(yǎng)基，每瓶培養(yǎng)基中接種5個莖段，每個處理接種20瓶(下同)。培養(yǎng)過程中每5 d觀察1次，統(tǒng)計培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色和生長情況，培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計誘導率。通過正交試驗(MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基與4種激素配比)獲得適宜誘導茶樹莖段愈傷組織的配方。

表4 莖段愈傷組織誘導培養(yǎng)基配方Table 4 Formula of callus induction medium for stem segment

篩選出茶樹莖段愈傷組織生長較好的培養(yǎng)基作為繼代培養(yǎng)基(表5)，將誘導出的愈傷組織用手術(shù)刀切下，置于莖段愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，繼續(xù)增殖誘導，每5 d觀察1次，培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計葉片愈傷組織增長大小及狀態(tài)。

表5 莖段愈傷組織繼代培養(yǎng)基配方Table 5 Formula of subculture medium for stem callus

1.2.4 培養(yǎng)條件

每升添加蔗糖30 g，瓊脂7 g，pH為5.7。在無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)，環(huán)境條件為(25±2) ℃，相對濕度60%～70%，避光暗培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

外植體按上述培養(yǎng)方式進行接種培養(yǎng)，每隔5 d對愈傷組織誘導情況、增殖情況及分化情況進行觀察記載，及時清理污染的外植體，通過數(shù)據(jù)分析選擇出適宜云南小葉種茶樹葉片及莖段愈傷組織誘導的培養(yǎng)方案。

利用Microsoft Excel 2007處理試驗數(shù)據(jù)；SPSS 24.0進行方差分析和Duncan多重對比。

試驗主要統(tǒng)計指標：

(1)

(2)

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響

通過篩選，具體篩選方法見表6，確定茶樹種子適宜消毒方式，降低污染率，有利于后續(xù)試驗的進行。結(jié)果表明，使用單一消毒劑比酒精和次氯酸鈉結(jié)合使用消毒效果差。綜合污染率、成活率及時間成本，茶種最佳消毒方法為次氯酸鈉消毒10 min、酒精消毒30 s。

表6 不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of different disinfection methods on seed germination

當消毒試劑只有4%次氯酸鈉時，污染率隨著次氯酸鈉消毒時間的增加而降低，同時，成活率也隨著次氯酸鈉消毒時間增加而降低，說明在4%次氯酸鈉溶液中浸泡時間過長會對植物材料產(chǎn)生毒害作用，從而影響種子的萌發(fā)率和成活率。當添加75%酒精時，污染率呈下降的趨勢，說明75%酒精對污染控制有明顯作用，但75%酒精消毒時間對成活率并無明顯影響。

在試管苗萌發(fā)過程中，觀察到部分茶苗出現(xiàn)變異現(xiàn)象，變異形態(tài)各異，如圖1所示，具體變異原因還有待進一步考證。

圖1 種子萌發(fā)的不同狀態(tài)Fig.1 Different state of seed germination

2.2 葉片愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)

葉片愈傷組織誘導試驗使用12種培養(yǎng)基，在含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計愈傷組織誘導率，有8種培養(yǎng)基可使葉片愈傷組織誘導率達到50%以上。在9號、10號、11號、12號培養(yǎng)基中，葉片愈傷組織誘導率達到85%以上。綜合出愈率、生長狀況以及方差分析結(jié)果，得出適宜誘導葉片愈傷組織培養(yǎng)基的配方是 B5+0.5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.1 mg/L 激動素(KT)，誘導率達到97.67%。由表7可知，B5培養(yǎng)基對葉片愈傷組織的誘導影響顯著，以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的愈傷組織誘導率均在85%以上。而以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的愈傷組織誘導率不理想，誘導率最低時僅為24.33%。

表7 葉片愈傷組織誘導結(jié)果分析Table 7 Analysis of callus induction from leaves

不同激素濃度配比也會影響出愈率和愈傷組織的生長狀況。在1/2MS培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導率隨著KT濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，KT濃度為0.1 mg/L和0.5 mg/L時，愈傷組織呈現(xiàn)黃褐色，生長狀況不佳且出愈率較低，僅為20%～30%；MS基本培養(yǎng)基中，愈傷組織生長狀況明顯優(yōu)于1/2MS培養(yǎng)基，愈傷組織誘導率隨著KT濃度的變化不規(guī)律，其中，0.5 mg/L激動素(KT)出愈率最高，且愈傷組織色澤嫩黃，質(zhì)量較好(表7)，生長狀況如圖2所示。B5培養(yǎng)基中質(zhì)0.1 mg/L激動素(KT)的葉片出愈率最高，隨著KT濃度的升高，愈傷組織誘導率逐漸下降，死亡率上升。

圖2 不同培養(yǎng)基誘導葉片愈傷組織生長狀況Fig. 2 Growth of leaf callus induced by different mediums

葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)試驗采用6種培養(yǎng)基，在含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后進行統(tǒng)計。由表8可知，3種基本培養(yǎng)基均可使愈傷組織增殖，但增殖效果有差別。統(tǒng)計結(jié)果表明，長勢最好的培養(yǎng)基為5號培養(yǎng)基，色澤嫩黃，質(zhì)地疏松，呈顆粒狀，長勢較好。長勢最差的是2號培養(yǎng)基，顏色呈黃褐色，質(zhì)地緊實，長勢較差。生長狀況如圖3所示。綜合增殖率和愈傷組織生長狀況，故適宜云南小葉種茶葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)基的配方是B5+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L激動素(KT)，與上述適宜誘導葉片愈傷組織的培養(yǎng)基配方相同。同時，綜合分析試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在3種基本培養(yǎng)基中，KT濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織增殖率較低，且增殖愈傷組織質(zhì)地緊實，生長狀態(tài)相對較差。

表8 葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)結(jié)果分析Table 8 Analysis of subculture result of leaf callus

圖3 不同培養(yǎng)基繼代葉片愈傷組織生長狀況Fig.3 Growth of callus in leaves subcultured on different mediums

2.3 莖段愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)

莖段愈傷組織誘導試驗使用12種培養(yǎng)基，在含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計愈傷組織誘導率，有4種培養(yǎng)基可使莖段愈傷組織誘導率達到80%以上。在其中8號中，莖段愈傷組織誘導率達到了93%。綜合出愈率、生長狀況以及方差分析結(jié)果，得出適宜誘導莖段愈傷組織的培養(yǎng)基配方是MS+1.5 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)+0.2 mg/L萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA)，且誘導出的愈傷組織質(zhì)地疏松，呈現(xiàn)嫩綠色，增殖速度較快。

由表9可知，在1/2MS培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導率出現(xiàn)隨著NAA濃度的升高而升高的趨勢，NAA濃度為0.1 mg/L時，愈傷組織呈現(xiàn)嫩白色(圖4)，生長狀況不佳且出愈率較低，僅為35%；MS基本培養(yǎng)基中，愈傷組織生長狀況優(yōu)于1/2MS和B5培養(yǎng)基，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織誘導率逐漸升高，NAA濃度為0.5 mg/L時出愈率最高，且愈傷組織色澤嫩綠，質(zhì)量較好；B5培養(yǎng)基中，KT濃度為0.1 mg/L時葉片的出愈率最高，隨著KT濃度的升高，愈傷組織誘導率呈下降的趨勢。

表9 莖段愈傷組織誘導結(jié)果分析Table 9 Analysis of Callus Induction from Stem Segment

圖4 不同培養(yǎng)基誘導莖段愈傷組織生長狀況Fig. 4 Growth of callus in stem segments induced by different media

莖段愈傷組織繼代培養(yǎng)試驗使用6種培養(yǎng)基，在含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后進行統(tǒng)計。3種基本培養(yǎng)基均可使愈傷組織增殖，但增殖效果有差別。統(tǒng)計結(jié)果(表10)表明，長勢最好的培養(yǎng)基為4號培養(yǎng)基，色澤嫩綠，質(zhì)地疏松，呈顆粒狀，長勢較好。長勢最差的是1號培養(yǎng)基，顏色呈嫩白色，質(zhì)地緊實，長勢較差。由此分析可知，云南小葉種茶莖段愈傷組織繼代培養(yǎng)基最佳配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，與上述適宜誘導莖段愈傷組織的培養(yǎng)基配方也相同。

表10 莖段愈傷組織繼代培養(yǎng)結(jié)果分析Table 10 Analysis of subculture result of stem callus

3 討論

培養(yǎng)無菌苗是實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化方面分子生物學育種的基礎，通過種子萌發(fā)培育試管苗是常用的技術(shù)路線。外植體表面污物和內(nèi)生菌、消毒方法不當、外植體取材時間和部位等均可引起污染[14-15]。目前，常用的消毒劑有75%酒精、0.1%升汞、次氯酸鈉(2%～5%)和抗生素類殺菌劑等，且使用聯(lián)合消毒劑能有效降低污染率。但部分消毒劑如升汞，在消毒中會有殘留，對植物材料有毒害作用，且會污染環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)在花梨木莖段消毒[16]和蘋果葉片消毒[17]中，使用次氯酸鈉消毒的褐化率較升汞低，且成活率較高。研究結(jié)果表明,適宜用于云南小葉種茶樹“十里香”種子消毒的組合為4%次氯酸鈉消毒10 min+75%酒精消毒30 s。次氯酸鈉消毒時間長，主要是由于種子較硬且表面污物較多。

培養(yǎng)基種類、激素種類及配比對愈傷組織誘導影響很大，在使用中需要具體探討[18-21]。研究發(fā)現(xiàn)在葉片愈傷組織誘導試驗中，在接種15 d后葉片開始膨大，葉緣隆起，葉片周圍開始出現(xiàn)黃白色愈傷組織，25 d后愈傷組織逐漸膨大，30 d后不同培養(yǎng)基上外植體的出愈率以及愈傷組織的生長狀況出現(xiàn)了明顯差別，以B5為基本培養(yǎng)基誘導出的愈傷組織比以1/2MS、MS為基本培養(yǎng)基誘導出的質(zhì)量好，愈傷組織呈現(xiàn)嫩黃色、質(zhì)地緊實，且出愈率達到97.67%。B5+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT適宜作為云南小葉種茶樹葉片的誘導培養(yǎng)基，誘導出的愈傷組織嫩黃致密，且不易褐化。在莖段愈傷組織誘導試驗中，適宜的配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。研究發(fā)現(xiàn)，相較于1/2MS和B5培養(yǎng)基，MS基本培養(yǎng)基更適宜于茶樹莖段愈傷組織的誘導。適宜葉片愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基是B5，而適宜莖段愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基是MS，這可能是與MS和B5培養(yǎng)基成分不同有關，MS培養(yǎng)的無機鹽離子濃度較高，而B5培養(yǎng)基無機鹽濃度較低。相對于MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基銨的濃度更低，而銨可能對有些培養(yǎng)基有抑制生長的作用[22-24]。也可能因為葉片和莖段的內(nèi)源激素水平不同，對外源激素的敏感度不同，培養(yǎng)結(jié)果也不同[25-26]。同時，在對比相同基本培養(yǎng)基、不同激素配比的愈傷組織誘導情況發(fā)現(xiàn)，適宜激素質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導效果較好，過低或過高質(zhì)量濃度都會使出愈率下降，且愈傷組織長勢較差，后期易褐化。這與白芝蘭等[27]的研究結(jié)果相似。在今后試驗中可以嘗試對不同種類和質(zhì)量濃度生長素和細胞分裂素進行組合，研究其對云南小葉種茶樹愈傷組織增殖和分化的影響。

不同生長素和細胞分裂素配比、不同基本培養(yǎng)基都會對愈傷組織的增殖產(chǎn)生直接影響[28-29]。適宜葉片愈傷組織增殖的繼代培養(yǎng)基配方與葉片誘導培養(yǎng)基的配方一致：B5+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L激動素(KT)；同樣，在莖段愈傷組織繼代試驗中發(fā)現(xiàn)，適宜增殖的繼代培養(yǎng)基配方也與莖段愈傷組織誘導培養(yǎng)基配方相同：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。不同細胞分裂素對愈傷組織增殖的影響也不同，葉片繼代培養(yǎng)基使用KT，愈傷組織呈現(xiàn)嫩黃色，質(zhì)地疏松；莖段繼代培養(yǎng)基使用6-BA，愈傷組織呈嫩綠色，質(zhì)地致密。試驗中還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)瓶后，部分愈傷組織容易褐化，在后續(xù)試驗中，可以研究不同抗褐化劑對愈傷組織褐化的抑制作用。同時，對比茶樹葉片和莖段的愈傷組織生長狀況發(fā)現(xiàn)，葉片愈傷組織生長狀態(tài)更佳，且質(zhì)地疏松，因此茶樹葉片更適宜作為建立茶樹細胞懸浮系的外植體。而關于云南小葉種茶樹葉片和莖段愈傷組織分化，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

以云南小葉種茶樹“十里香”種子為外植體，經(jīng)消毒處理后培育出無菌試管苗?；跓o菌試管苗的葉片和莖段進行愈傷組織的誘導和增殖，以期為云南小葉種茶樹組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供參考，也為云南小葉種茶樹的進一步研究奠定了基礎。試驗成功誘導出質(zhì)量較優(yōu)且生長狀態(tài)良好的愈傷組織，但在后續(xù)試驗中，要繼續(xù)研究如何克服培養(yǎng)中后期褐化問題，誘導愈傷組織分化不定芽以及不定芽生根和移栽需要進行試驗研究。