馬鈴薯低溫脅迫的生理響應(yīng)及耐寒性綜合評(píng)價(jià)

丁紅映，田宇豪，李 青，楊佳怡，胡新喜，熊興耀,2，秦玉芝*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院 /湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosunL.)是茄科茄屬一年生草本植物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的世界第四大糧食作物，在我國(guó)種植區(qū)域廣泛，面積和產(chǎn)量均居世界首位[1-2]。我國(guó)南方冬作區(qū)馬鈴薯種植時(shí)間主要在晚秋、冬季和早春，期間常常遭遇霜凍以及持續(xù)低溫天氣，影響幼苗正常生長(zhǎng)，造成減產(chǎn)甚至絕收[3]。因此，研究馬鈴薯材料的耐寒性，選育耐寒性品種，是南方冬作區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要手段之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分及代謝過(guò)程與中間產(chǎn)物的一系列變化。因此，生理響應(yīng)分析是研究植物耐寒性常見(jiàn)的手段。研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯在同等光合有效輻射下，凈光合速率隨環(huán)境溫度的下降而降低，10 ℃條件下的馬鈴薯凈光合速率與基因型耐寒性呈正相關(guān)[4]。植物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧(ROS)動(dòng)態(tài)平衡會(huì)因低溫脅迫被打破，使得ROS含量急劇増加或者先上升后下降趨勢(shì)，不同基因型石榴ROS含量增幅不同，且到達(dá)峰值的溫度也不同[5-6]。環(huán)境溫度變化顯著影響細(xì)胞含水量。其中，不同低溫處理過(guò)程中自由水/束縛水比值變化關(guān)注較多。普遍認(rèn)為自由水/束縛水比值較低，細(xì)胞液濃度高，保水能力強(qiáng)，植物耐寒能力較強(qiáng)[7]。脯氨酸是一種親水性有機(jī)溶劑，與細(xì)胞水勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。魏亮等發(fā)現(xiàn)馬鈴薯植株脯氨酸含量與耐寒性之間具有高度相關(guān)性，耐寒性越強(qiáng)的植株脯氨酸含量越高[8]。丙二醛(MDA)能夠引發(fā)化學(xué)加成作用，使生物膜中的結(jié)構(gòu)蛋白和酶發(fā)生聚合和交聯(lián)，喪失了原有的結(jié)構(gòu)和催化功能，抑制細(xì)胞保護(hù)酶活性和降低抗氧化物的含量，從而加劇膜脂過(guò)氧化[9]。MDA 含量越高，膜脂過(guò)氧化程度越高，說(shuō)明膜受傷越嚴(yán)重。黃超等研究表明，甜瓜在4℃低溫處理8h后，不同品種間的丙二醛含量達(dá)到極顯著水平，隨著脅迫時(shí)間增加，丙二醛含量升高，但其顯著水平有所降低[10]。植物低溫脅迫生理響應(yīng)研究一直備受關(guān)注，但由于植物耐寒性途徑的多樣性與復(fù)雜性仍無(wú)法提出完整的耐寒機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究通過(guò)對(duì)不同耐寒性馬鈴薯材料的抗氧化酶活性，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和膜脂過(guò)氧化3種生理途徑中關(guān)鍵因子進(jìn)行耐寒性關(guān)聯(lián)綜合分析，評(píng)價(jià)這些生理指標(biāo)在馬鈴薯耐寒性特征的貢獻(xiàn)率大小?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用主成分分析、隸屬函數(shù)和聚類(lèi)分析法，綜合評(píng)價(jià)16份馬鈴薯材料的耐寒性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其低溫處理

試驗(yàn)于2018年10月初，在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯工程中心進(jìn)行，供試的16份馬鈴薯材料：隴薯8號(hào)、隴薯7號(hào)、中薯11號(hào)、華彩1號(hào)、300046.22、冀張14號(hào)、acanle-6、中薯8號(hào)、acanle-4、396034.268、F170、黃麻子、E1、AV9、AV1、634777。組培苗擴(kuò)繁，每一種資源5瓶，每瓶5～6株，在光照強(qiáng)度3200 lx，光周期為光照/黑暗(14/10 h)，溫度為20～22 ℃的組培室，生長(zhǎng)25 d，移栽于栽培盆中，置于光照強(qiáng)度為4000 lx，光周期為光照/黑暗(14/10 h)，溫度為20～22 ℃的人工氣候室，生長(zhǎng)50 d。

將離體馬鈴薯功能葉片置于程序降溫儀，脅迫溫度為-3 ℃，脅迫時(shí)間為6 h。低溫脅迫處理后的葉片，混合取樣，測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。同時(shí)，以正常生長(zhǎng)溫度(20 ℃)、脅迫時(shí)間為0 h為對(duì)照。

1.2 指標(biāo)的測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

過(guò)氧化氫酶(CAT) 活性、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、過(guò)氧化物酶(POD) 活性參照李合生的測(cè)定方法[11]。游離脯氨酸(PRO)含量采用酸性茚三酮法，可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)法，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。測(cè)試分析是根據(jù)試劑盒的說(shuō)明(科銘，蘇州)利用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定分析。

耐寒系數(shù)和隸屬函數(shù)參照謝季堅(jiān)[12]的方法:

耐寒系數(shù)(%)=處理?xiàng)l件下的測(cè)量值/對(duì)照條件下的測(cè)量值×100 %

(1)

耐寒系數(shù)轉(zhuǎn)換為隸屬函數(shù)公式如下:

隸屬函數(shù)u(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

反隸屬函數(shù)u(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

式中，u(Xij)第i個(gè)品種第j個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。Xij為耐寒系數(shù)，Xmin為參試品種中第j個(gè)指標(biāo)耐寒系數(shù)的最小值、Xmax為參試品種中第j個(gè)指標(biāo)耐寒系數(shù)的最大值。如果耐寒指標(biāo)與耐寒程度呈正相關(guān)，用公式(2)計(jì)算，反之，則用公式(3)計(jì)算。

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)、聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯不同生化指標(biāo)的影響及耐寒系數(shù)分析

根據(jù)1.2耐寒系數(shù)的計(jì)算公式，求出各單項(xiàng)指標(biāo)的耐寒系數(shù)。由各單項(xiàng)指標(biāo)的耐寒系數(shù)可看出，不同馬鈴薯材料，生理生化指標(biāo)都發(fā)生了變化(表1)。分析過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，超氧化物歧化酶(SOD)活性，過(guò)氧化物酶(POD)活性等抗氧化酶。其中，CAT活性耐寒系數(shù)“F170”的值最大，為1.663±0.244，“acanle-6”的值最小，為0.562±0.19；SOD活性耐寒系數(shù)“F170”的值也是最大，為5.926±0.041，“隴薯7號(hào)”最小，為0.582±0.005； POD活性耐寒系數(shù)“300046.22”的值最大，為1.923±0.035，“acanle-6”的值最小，為0.528±0.036。由表1可知，這3種抗氧化酶的耐寒系數(shù)極值存在顯著性的差異(P<0.05)。丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受害的重要標(biāo)志。MDA含量的耐寒系數(shù)“AV1”最大，為1.832±0.045，“acanle-4”最小，為0.745±0.067。

表1 低溫脅迫下16個(gè)馬鈴薯材料生理生化指標(biāo)的變化

分析滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在低溫響應(yīng)中的變化，游離脯氨酸(PRO)含量耐寒系數(shù)“AV9”最大，為3.826±0.518 %，“634777”最小，為0.658±0.043，說(shuō)明不同馬鈴薯通過(guò)PRO來(lái)提高對(duì)低溫的脅迫的能力存在差異性；可溶性糖(SS)含量耐寒系數(shù)“AV1”最大，為4.533±0.306，“隴薯8號(hào)”最小，為0.429±0.03；可溶性蛋白(SP)含量耐寒系數(shù) “黃麻子”最大，2.140±0.183耐寒性，“634777”最小，為0.542±0.097耐寒性。

2.2 不同馬鈴薯材料7個(gè)生化指標(biāo)主成分分析

從表2可知，在相關(guān)系數(shù)矩陣中，CAT、SOD、POD活性，游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，造成7個(gè)指標(biāo)間信息的交叉。不同的指標(biāo)系數(shù)對(duì)不同材料的耐寒性的評(píng)價(jià)不盡相同。采用主成分分析法對(duì)各項(xiàng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表2 馬鈴薯幼苗耐寒性指標(biāo)間的相關(guān)性

對(duì)16個(gè)馬鈴薯材料的CAT酶活性，SOD酶活性，POD酶活性，游離脯氨酸含量，可溶性糖含量，可溶性蛋白含量和丙二醛含量7個(gè)指標(biāo)的耐寒系數(shù)進(jìn)行主成分分析，由表3可知，將7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化成7個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)前4個(gè)綜合指標(biāo)(CI1-CI4)的貢獻(xiàn)率分別是34.829 %，22.108 %，14.48 %，12.312 %，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)83.729 %(大于80 %)，表明采用這4個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)可以對(duì)不同馬鈴薯材料的耐寒性進(jìn)行鑒定，具有較強(qiáng)的代表性。根據(jù)成分矩陣來(lái)看，在4個(gè)相互獨(dú)立的綜合的指標(biāo)中，丙二醛(0.925)，SOD酶活性(0.757)，可溶性蛋白(0.717)，SOD酶活性(-1.07)活性指標(biāo)占了較大的比重，SOD酶活性是綜合指標(biāo)2(CI2)和綜合指標(biāo)4(CI4)的關(guān)鍵因素，發(fā)生了信息間的重疊，所以可以將這3個(gè)指標(biāo)看作是影響馬鈴薯耐寒性的關(guān)鍵因素。

表3 各綜合指標(biāo)的系數(shù)以及貢獻(xiàn)率

2.3 不同馬鈴薯材料耐寒性綜合評(píng)價(jià)

2.3.1 隸屬函數(shù)分析 從表4可知，在低溫脅迫下，綜合指標(biāo)U1中，“AV1”的值最大(1.000)，“中薯8號(hào)”最小(0)，說(shuō)明在CI1這一綜合指標(biāo)上，“AV1”的耐寒性最強(qiáng)，“中薯8號(hào)”耐寒性最弱，同理，在CI2 這一綜合指標(biāo)上，“F170”的耐寒性最強(qiáng)，“300046.22”的耐寒性最弱；在CI3這一綜合指標(biāo)上，“華彩1號(hào)”的耐寒性最強(qiáng)，“acanle-6”的耐寒性最弱，在CI4 這一綜合指標(biāo)上，“AV9”的耐寒性最強(qiáng)，“冀張14號(hào)”的耐寒性最弱。綜合評(píng)價(jià)得，“黃麻子”耐寒性最強(qiáng)，“634777”耐寒性最弱。

2.3.2 權(quán)重的確定 根據(jù)4個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率的大小，計(jì)算得到4個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重分別是0.416，0.264，0.173，0.147。

2.3.3 綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)公式，計(jì)算得到不同馬鈴薯材料的綜合耐寒能力D值(表4)，“黃麻子”最大(0.667)，說(shuō)明其耐寒性最強(qiáng)，“634777”最小(0.168)，其耐寒性最弱。根據(jù)D值對(duì)16份馬鈴薯材料的耐寒能力排序：“黃麻子”>“AV1”>“F170”>“AV9”>“華彩1號(hào)”>“隴薯8號(hào)”> “acanle-4”>“中薯11號(hào)”>“396034.268”>“300046.22”>“中薯8號(hào)”>“冀張14號(hào)”>“隴薯7號(hào)”>“acanle-6”>“E1”>“634777”。

表4 不同材料的綜合指標(biāo)值，權(quán)重，U(X)，D值以及綜合評(píng)價(jià)

2.4 隸屬函數(shù)和聚類(lèi)分析

將16份馬鈴薯材料的CAT、SOD、POD活性，游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量主成分分析的D值，進(jìn)行隸屬函數(shù)和聚類(lèi)分析(表5)，隸屬函數(shù)法對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行排序，耐寒性鑒定的隸屬函數(shù)度0.7≤u(x) ≤1為強(qiáng)耐寒；0.3 ≤u(x) ≤0.69 為中等耐寒；0.00≤u(x)<0.29為弱耐寒。強(qiáng)耐寒材料3份，包括“黃麻子”、“AV1”和“F170”，中等耐寒材料7份，其中“AV9”、“華彩1號(hào)”和“隴薯8號(hào)”排名比較靠前。弱耐寒材料6份，其中“63477”和“E1”耐寒性最差。聚類(lèi)分析分成3類(lèi)，見(jiàn)圖1。鑒定出Ⅰ類(lèi)(強(qiáng)耐寒)材料2份，包括“黃麻子”和“AV1”，Ⅱ類(lèi)(中等耐寒)材料8份，分別為“F170”、“AV9”、“華彩1號(hào)”、“中薯8號(hào)”、“acanle-4”、“中薯11號(hào)”、“396034.268”、“300046.22”。Ⅲ類(lèi)(弱耐寒)材料6份，分別為“中薯8號(hào)”、“冀張14號(hào)”、“隴薯7號(hào)”、“acanle-6”、“E1”、“634777”。

表5 馬鈴薯材料隸屬函數(shù)和聚類(lèi)分析耐寒性分級(jí)

圖1 16份馬鈴薯材料耐寒性的系統(tǒng)聚類(lèi)結(jié)果

3 討 論

逆境導(dǎo)致活性氧的積累使自由基的產(chǎn)生與清除這一動(dòng)態(tài)平衡打破，從而造成膜系統(tǒng)的損傷甚至瓦解，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化終產(chǎn)物 MDA 含量的增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)是低溫冷害發(fā)生的首要部位,低溫引起的細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)的破壞是導(dǎo)致植株寒害損傷和死亡的根本原因[17]。所以丙二醛的含量，在一定程度上代表了膜脂受傷害的程度，也能夠反應(yīng)植物耐寒性的強(qiáng)弱。在本研究中，丙二醛是馬鈴薯耐寒性的首要關(guān)鍵因子。植物的耐寒性是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀，采用單一的指標(biāo)、單一分析方法難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)植物的耐寒性[18]。本研究測(cè)定低溫脅迫下16份馬鈴薯材料7個(gè)生化指標(biāo)，采用主成分分析，隸屬函數(shù)和聚類(lèi)分析3種分析方法對(duì)研究材料的耐寒性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。研究結(jié)果認(rèn)為二醛含量、可溶性蛋白含量和SOD活性可作為評(píng)價(jià)馬鈴薯耐寒性的重要參考指標(biāo)，這3個(gè)指標(biāo)涉及膜脂過(guò)氧化，抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)3種不同的生理響應(yīng)過(guò)程，再次說(shuō)明馬鈴薯耐寒性的復(fù)雜性。