瑪瑙紅櫻桃病毒病小RNA的高通量測(cè)序檢測(cè)

洪 怡， 文 壯， 田 田， 文曉鵬

(貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

植物病毒病又稱為植物癌癥，給農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物帶來(lái)嚴(yán)重危害，使作物產(chǎn)量減少、品質(zhì)變劣，每年在全球造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)200 億美元[1]。病毒病是嚴(yán)重危害到櫻桃生產(chǎn)的重要病害，侵染櫻屬病毒主要有 68種，侵染大櫻桃的病毒約有 34 種，較常見(jiàn)主要有 20 種[2]。目前有關(guān)櫻桃病毒病的研究多側(cè)重于大櫻桃病毒病相關(guān)研究，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的大櫻桃病毒病病原有櫻桃病毒 A (CherryvirusA,CVA)、櫻桃綠斑駁病毒 (Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)、櫻桃小果病毒 1 (Littlecherryvirus1,LChV-1)、櫻桃小果病毒 2 (Littlecherryvirus2,LChV-2)、李樹(shù)皮壞死與莖痘伴隨病毒 (Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV)、李屬壞死環(huán)斑病毒 (Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV)、李矮縮病毒 (Prunedwarfvirus,PDV) 和黃瓜花葉病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV) 等[3-5]。趙慧等[6]在用于砧木使用的中國(guó)櫻桃實(shí)生苗上檢測(cè)出李屬壞死斑病毒、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒、蘋果褪綠葉斑病毒、櫻桃壞死銹斑病毒(cherrynecroticrustymottlevirus,CNRMV)和櫻桃小果病毒 2?，旇Ъt櫻桃(Prunuspseudoceresus‘Manaohong’)是貴州省經(jīng)多年選育而成的地方優(yōu)良品種[7-8]，經(jīng)過(guò)20余年的推廣，目前是貴州省種植面積最大的櫻桃品種?，旇Ъt櫻桃營(yíng)養(yǎng)豐富，成熟期早，市場(chǎng)價(jià)格高，在貴州脫貧攻堅(jiān)、生態(tài)文明建設(shè)、農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、增加農(nóng)民收入等方面發(fā)揮了重要作用，具有較高的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益。在種植過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，瑪瑙紅櫻桃出現(xiàn)大面積葉片黃化的疑似病毒侵染癥狀，甚至導(dǎo)致樹(shù)體死亡，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及質(zhì)量。檢測(cè)瑪瑙紅櫻桃病毒病，對(duì)了解病毒病發(fā)病情況及防治和控制病毒病具有重要意義。

檢測(cè)植物病毒的傳統(tǒng)方法有血清學(xué)檢測(cè)、電子顯微鏡觀察、指示植物接種和基因芯片等，若是未知病原物，則耗時(shí)長(zhǎng)、效率低下，而且容易出現(xiàn)檢測(cè)誤差等問(wèn)題[9-11]。隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量小 RNA 測(cè)序技術(shù)開(kāi)始進(jìn)入植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域。植物在受到病毒侵染時(shí)會(huì)形成干擾小 RNA，干擾小 RNA 作為一種防御機(jī)制，廣泛存在于植物對(duì)抗各種病原物侵染的過(guò)程中，若植物被病毒感染，在高通量測(cè)序中獲得的小 RNA 序列庫(kù)中就會(huì)含有來(lái)源于病毒的序列，通過(guò)比對(duì)分析就能得到病毒相關(guān)序列[12-13]。高通量測(cè)序技術(shù)因其快速、靈敏的檢測(cè)特點(diǎn)已經(jīng)成為植物病毒學(xué)研究的有力工具，是一種廣譜性的病毒檢測(cè)手段，可檢測(cè)到未知病毒。VERBEEK 等[14]于2011年通過(guò)高通量測(cè)序在荷蘭種植的萵苣上檢測(cè)到1種新病毒，這種病毒導(dǎo)致萵苣葉基部壞死并伴隨葉卷曲。小 RNA 的高通量測(cè)序可在病原物侵染早期進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，即在植物被感染早期，還未出現(xiàn)明顯癥狀之前就可檢測(cè)到病原物的存在，為后續(xù)的病原物防治爭(zhēng)取時(shí)間[15]。目前，鮮見(jiàn)對(duì)貴州櫻桃瑪瑙紅病毒病的研究報(bào)道，故采用高通量技術(shù)分析瑪瑙紅櫻桃可能攜帶的病毒病種類，以期為瑪瑙紅櫻桃病毒病的防治與控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

瑪瑙紅櫻桃葉片，采自貴州省福泉市黃絲鎮(zhèn)、畢節(jié)市納雍縣、六盤水市六枝特區(qū)的瑪瑙紅櫻桃種植園。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理及小RNA測(cè)序 分別采集納雍(NY)、福泉(FQ)、六枝(LZ)3個(gè)地區(qū)櫻桃葉片，每個(gè)采樣點(diǎn)分別選取 2個(gè)試驗(yàn)樣品，采集時(shí)間為 6月，選取黃化葉片(參照?qǐng)D1進(jìn)行選取)，液氮快速處理后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于干冰中，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行總RNA 的提取及質(zhì)檢、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序等，測(cè)序平臺(tái)為Illumiina Hiseq 2500。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾及18～26 nt小RNA篩選 對(duì)原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾，去掉低質(zhì)量、接頭和過(guò)長(zhǎng)片段，并去掉 3’接頭后長(zhǎng)度小于 18 nt和大于 26 nt的片段數(shù)，獲得 clean reads片段。由于病毒感染的植物，富集的病毒小RNA長(zhǎng)度主要分為3類：21 nt，22 nt和24 nt[16]，因此從clean reads中篩選長(zhǎng)度 18～26 nt 的sRNA進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 樣品病毒分析 使用 Velvet(參數(shù) K-mer17)對(duì)篩選所得的小 RNA進(jìn)行序列拼接，獲得較長(zhǎng)的重疊群(contigs)。將拼接所得的contigs與寄主基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，除去寄主基因組序列；將剩余的重疊群用 blastn與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，尋找與這些重疊群高度同源的序列；用 blastx將沒(méi)有找到高度同源序列的 contigs與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，尋找與 contigs部分同源的序列；將contigs高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核酸數(shù)據(jù)庫(kù)和病毒蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出與病毒序列同源的 contigs；為評(píng)估該候選病毒的有效性，用 bowtie 將過(guò)濾后的小 RNA(允許1 mismatch)，與 GenBank Virus RefSeq中NY 篩選出的候選病毒核酸序列組成的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并將小 RNA 進(jìn)一步定位到該數(shù)據(jù)庫(kù)中，鑒定出病毒小 RNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃葉片小RNA的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量

2.1.1 小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量 從表1可知，納雍、福泉、六枝3個(gè)文庫(kù)分別獲得21 203 575條、33 782 705條和324 192 271條原始讀數(shù)(raw reads)，去除低質(zhì)量、污染讀數(shù)后，最終獲得2 063 199條、32 772 749條和31 642 051條干凈讀數(shù)(clean reads)，其 clean reads 比例均達(dá)95% 以上，滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

表1 櫻桃葉片小RNA的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.1.2 18～26 nt小RNA條數(shù) 從表2可知，納雍、福泉和六枝樣品獲得長(zhǎng)度介于18 ～ 26 nt的 小 RNA分別為17 645 715 條、25 667 682條和28 004 194條。從測(cè)序獲得的小 RNA 長(zhǎng)度看，小 RNA 長(zhǎng)度主要在 21～24 nt，尤其以 21 nt 和 24 nt 占比較高(圖2)，納雍、福泉、六枝樣品的 21 nt小 RNA分別占篩選出小 RNA的 20.92%、21.07%和23.39%，24 nt小 RNA分別占 48.57%、39.63%和45.10%。

表2 櫻桃葉片18～26 nt小RNA的條數(shù)

2.2 櫻桃葉片小 RNA的拼接與注釋

從表3可知，對(duì)篩選所得18～26 nt的小 RNA進(jìn)行拼接，納雍、福泉和六枝分別獲得 4 514條、5 959條和 7 046條contigs。納雍樣本在病毒核酸、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到的contigs 最多，分別有11條和40 條，福泉樣品被病毒核酸、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的contigs 分別有1條 和 19 條，六枝樣品被病毒核酸、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的contigs 分別有 2條 和 17 條。

表3 櫻桃葉片小RNA在數(shù)據(jù)庫(kù)的 contig 注釋數(shù)量

2.3 候選病毒

從表4可知，納雍樣本中鑒定到 5 種候選病毒，其中與 Little cherry virus 2 同源的 contigs 最多，為49條；其次與急球藻噬菌體(Synechococcusphage) 和西部云杉色卷蛾顆粒病毒(Choristoneuraoccidentalisgranulovirus) 同源的 contigs分別為 5條和 2條；檢測(cè)到與甘薯?xiàng)U狀DNA病毒B(SweetpotatobadnavirusB)、花椰菜花葉病毒(Cassavaveinmosaicvirus)同源的 contigs 均為1條。福泉樣本中檢測(cè)到的主要病毒包括Synechococcusphage、SweetpotatobadnavirusB、Choristoneuraoccidentalisgranulovirus和花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus)等 6 種，以Synechococcusphage和SweetpotatobadnavirusB同源的 contigs 較高，分別為 7條 和 3條。六枝樣本中檢測(cè)到的病毒Synechococcusphage和Cauliflowermosaicvirus同源的 contigs 分別為 8條 和 2條，其余與候選病毒同源的 contigs 均為 1條。

表4 櫻桃葉片檢測(cè)病毒的類別

通過(guò)對(duì) 3個(gè)采樣地的樣本候選病毒的初步篩選，納雍樣本中鑒定到的櫻桃小果病毒 2可能為櫻桃葉片中的主要病毒，其余2組樣本中鑒定的主要病毒為噬菌體或者昆蟲(chóng)病毒，含有少量的植物病毒。通過(guò)對(duì)候選病毒的有效性評(píng)估、鑒定，在納雍樣本中的候選病毒庫(kù)中，櫻桃小果病毒 2比對(duì)到的 reads 有6 014條，占總參考序列 mapped reads的75.62%，說(shuō)明篩選候選病毒有效，納雍樣本中包含的病毒主要為櫻桃小果病毒 2(表 5)。

表5 納雍樣本候選病毒的有效性評(píng)估

3 結(jié)論與討論

經(jīng)檢測(cè)鑒定，貴州省瑪瑙紅櫻桃納雍樣本中的候選病毒庫(kù)中，櫻桃小果病毒 2比對(duì)到的 reads 有 6 014條，占總參考序列 mapped reads的75.62%，存在病毒病。納雍縣瑪瑙紅櫻桃產(chǎn)區(qū)主要存在櫻桃小果病毒 2，其余部分產(chǎn)區(qū)櫻桃黃化癥狀并非由病毒引起。

常規(guī)的病毒檢測(cè)方法電鏡法、酶聯(lián)免疫法 (ELISA) 、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 (PCR)等，都有一定的局限性，如只適用于研究比較清楚的病毒，針對(duì)性強(qiáng)，對(duì)于新病毒的發(fā)現(xiàn)較困難，且易漏檢。與傳統(tǒng)方法相比，高通量小 RNA測(cè)序檢測(cè)病毒病是利用植物抗病毒機(jī)制建立的一種檢測(cè)手段，對(duì)小 RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，然后組裝總小 RNA來(lái)檢測(cè)病毒，能同時(shí)鑒定樣品中存在的所有病毒，高通量測(cè)序技術(shù)在病毒的發(fā)現(xiàn)與鑒定研究中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢(shì)[17-18]，能夠快速地檢測(cè)樣品中存在的所有病毒，具有更高的靈敏度和信噪比，并且檢測(cè)結(jié)果不存在假陽(yáng)性。隨著測(cè)序成本的不斷降低，基于小 RNA深度測(cè)序技術(shù)逐漸成為檢測(cè)植物病毒最準(zhǔn)確、最常用的方法[19]。研究利用小 RNA測(cè)序及組裝技術(shù)在瑪瑙紅櫻桃上檢測(cè)到8種候選病毒，其中，櫻桃小果病毒 2為主要病毒，且候選病毒的有效性評(píng)估也證明了主要病毒為櫻桃小果病毒2，櫻桃小果病毒 2屬于長(zhǎng)線型病毒科葡萄卷葉病毒屬，僅感染李屬植物，傳染性強(qiáng)，可引起果實(shí)變小，不能成熟等，嚴(yán)重影響櫻桃的商品價(jià)值[20]。

在此次檢測(cè)中，在納雍主產(chǎn)區(qū)檢測(cè)出櫻桃小果病毒 2，其他 2個(gè)產(chǎn)區(qū)未檢出，推測(cè)櫻桃小果病毒 2還未在全省大面積傳播，部分地區(qū)瑪瑙紅櫻桃的黃化現(xiàn)象應(yīng)是由其他原因?qū)е隆＜{雍是瑪瑙紅櫻桃的發(fā)源地，許多苗木都出自納雍，雖然目前病毒病還未大范圍傳播，但櫻桃小果病毒 2致病性強(qiáng)，傳播快，若不及時(shí)防控，將會(huì)給貴州的瑪瑙紅櫻桃產(chǎn)業(yè)帶了巨大打擊，相關(guān)部門應(yīng)引起重視。