D-二聚體2種檢測方法的參考值建立和排除靜脈血栓栓塞癥臨界值設(shè)定*

張鴻艷，任靜，楊晴，門劍龍(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院精準醫(yī)學中心，天津300052)

D-二聚體是反映凝血活化和繼發(fā)性纖溶亢進的標志物，其血漿濃度與血管內(nèi)纖維蛋白負荷密切相關(guān)，在臨床上已成為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)排除診斷和風險評估的重要指標[1-2]。目前，國內(nèi)實驗室主要用高敏微粒凝集定量法和酶聯(lián)免疫熒光法檢測D-二聚體，應(yīng)用效果良好。近年來，又出現(xiàn)了2種D-二聚體檢測系統(tǒng)，分別是采用纖維蛋白原等量單位(fibrinogen equivalent units，F(xiàn)EU)的化學發(fā)光法和采用D-二聚體單位(D-dimer units，DDU)的膠乳免疫比濁法。根據(jù)文獻[3-4]，這2種方法的健康人參考值和排除診斷臨界值有別于既往的D-二聚體檢測方法，尤其缺乏中國人群的基線數(shù)據(jù)，且由于在臨床上的應(yīng)用時間較短，實驗室對其在輔助臨床診斷方面的敏感性和特異性也了解不足。因此，本研究通過2個亞組研究，分析2 431例不同年齡的健康人、200例VTE患者以及200例非VTE疾病患者的血漿D-二聚體數(shù)據(jù)，初步獲得2種新型D-二聚體檢測方法的健康人參考值、排除VTE臨界值及其診斷性能。

1 材料與方法

1.1研究對象

1.1.1健康人第1組 收集2015年1月—2016年1月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院的體檢健康者1 207例，男601例，女606例，年齡20～69歲。排除標準：酗酒史、3個月內(nèi)獻血、高血壓、肝腎疾病、全身炎性疾病、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、哺乳期、妊娠、肥胖、吸煙、3個月內(nèi)的用藥史和手術(shù)史。標本用于建立化學發(fā)光法參考值。

1.1.2健康人第2組 收集2016年1月—12月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院的體檢健康者1 224例，男609例，女615例，年齡20～68歲，排除標準同1.1.1。標本用于建立免疫比濁法參考值。

1.1.3VTE患者組 選擇2015年3月—2016年12月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院收治的初診患者200例，男100例，女100例，年齡(55.2±9.4)歲，其中致死性肺栓塞(pulmonary embolism，PE)患者27例，非致死性PE患者22例，下肢深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)合并PE患者16例，DVT患者135例；診斷經(jīng)血管造影、超聲、計算機斷層掃描或肺通氣/灌注掃描證實，符合《肺血栓栓塞癥診治與預防指南》和《中國血栓性疾病防治指南》關(guān)于急性靜脈血栓栓塞癥的診斷標準[1-2]。

1.1.4非VTE疾病對照組 選擇2015年3月—2016年12月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院收治的患者200例，男99例，女101例，年齡(55.6±9.2)歲，其中急性冠脈綜合征患者71例，普通外科術(shù)后患者66例，創(chuàng)傷患者61例，診斷均經(jīng)臨床、實驗室及影像學檢查證實。入組患者除外活動性惡性腫瘤和妊娠期患者。非VTE疾病對照組與VTE患者組的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過天津醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會審批(ZYY-JY-2017-01)。

1.2方法 靜脈血標本以枸椽酸鈉抗凝(109 mmol/L，3.2%)按1∶9進行抗凝，2 664×g離心10 min，取上層乏血小板血漿進行測定，于采集后4 h內(nèi)測定血漿D-二聚體。(1)化學發(fā)光法：在美國Instrumentation Laboratoy公司ACL AcuStar化學發(fā)光儀上用其配套HemosIL?AcuStar D-dimer試劑盒測定，按說明書進行操作；(2)膠乳免疫比濁法：在日本積水公司CP 2000型全自動血液凝固儀上用其配套試劑盒測定，按說明書進行操作。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，多組間數(shù)據(jù)比對采用Kruskal-WallisH檢驗，兩組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用ROC曲線評價D-二聚體的診斷性能。

2 結(jié)果

2.1健康人第1組化學發(fā)光法D-二聚體測定結(jié)果

2.1.1各年齡段不同性別間結(jié)果比較 在20～30歲組、31～40歲組、41～50歲組、51～60歲組中，女性的血漿D-二聚體水平均高于男性，差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為<0.001、<0.001、<0.001和0.012)；在≥61歲組中，男、女健康人間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.114)。見表1。

表1 健康人第1組化學發(fā)光法D-二聚體檢測結(jié)果(ng/mL FEU，M[P25，P75])

2.1.2健康人第1組不同年齡段間結(jié)果比較 健康人第1組血漿D-二聚體水平隨年齡增長而增高，各年齡段間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=159.088，P<0.001)。其中20～30歲組與31～40歲組比較、31～40歲組與41～50歲組比較，差異無統(tǒng)計學意義(U值分別為28 721和26 321，P均>0.05)；41～50歲組與51～60歲比較、51～60歲組與≥61歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(U值分別為22 070和2 262，P均<0.001)。

2.1.3男性健康人群不同年齡段間結(jié)果比較 男性健康人總體血漿D-二聚體水平隨年齡增長而增高，各年齡段間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=134.853，P<0.001)。男性20～30歲組與31～40歲組比較，差異無統(tǒng)計學意義(U=7 126，P=0.890)；31～40歲組與41～50歲組比較、41～50歲組與51～60歲組比較、51～60歲組與≥61歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(U值分別為5 839、4 704和5 602，P均<0.05)。

2.1.4女性健康人群不同年齡段間結(jié)果比較 女性健康人總體血漿D-二聚體水平隨年齡增長而增高，各年齡段間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=44.330，P<0.001)。女性20～30歲組與31～40歲組比較、31～40歲組與41～50歲組比較，差異無統(tǒng)計學意義(U值分別為7 129、7 200，P均>0.05)；41～50歲組與51～60歲組比較、51～60歲組與≥61歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(U值分別為6 335和5 675，P均<0.05)。

2.2健康人第2組免疫比濁法D-二聚體測定結(jié)果

2.2.1各年齡段不同性別間結(jié)果比較 在20～30歲組、31～40歲組、41～50歲組、51～60歲組中，女性的血漿D-二聚體水平均高于男性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；在≥61歲組中，男、女健康人間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125)，見表2。

表2 健康人第2組免疫比濁法D-二聚體檢測結(jié)果(ng/mL DDU，M[P25，P75])

2.2.2總?cè)巳翰煌挲g段間結(jié)果比較 健康人血漿D-二聚體水平隨年齡增長而增高，各年齡段間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=89.634，P<0.001)。其中20～30歲組與31～40歲組比較、41～50歲組與51～60歲比較，差異無統(tǒng)計學意義(U值分別為30 307和27 526，P均>0.05 )；31～40歲組與41～50歲組比較、51～60歲組與≥61歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(U值分別為23 300和22 953，P均<0.05)。

2.2.3男性健康人群不同年齡段間結(jié)果比較 男性健康人總體血漿D-二聚體水平隨年齡增長而增高，各年齡段間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=126.779，P<0.001)。男性20～30歲組與31～40歲組比較、41～50歲組與51～60歲組比較，差異無統(tǒng)計學意義(U值分別為7 102、6 270，P均>0.05)；31～40歲組與41～50歲組比較、51～60歲組與≥61歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(U值分別為5 466和3 812，P均<0.05)。

2.2.4女性健康人群不同年齡段間結(jié)果比較 女性健康人總體血漿D-二聚體水平隨年齡增長而增高，各年齡段間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.207，P<0.007)。女性20～30歲組與31～40歲組比較、41～50歲組與51～60歲組比較、51～60歲組與≥61歲組比較，各組間差異均無統(tǒng)計學意義(U值分別為8 030、7 424和6 728，P均>0.05)；31～40歲組與41～50歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義(U=5 821，P=0.005)。

2.32種D-二聚體檢測方法的參考值 根據(jù)2.1～2.2數(shù)據(jù)，初步獲得2種D-二聚體檢測方法的參考值(計算95%百分位數(shù)上側(cè)限值)。化學發(fā)光法(ACL AcuStar化學發(fā)光儀)總體人群為<528 ng/mL，其中≤50歲男性為<271 ng/mL，>50歲男性為<637 ng/mL；≤50歲女性為<441 ng/mL，>50歲女性為<673 ng/mL。免疫比濁法(CP 2000型全自動血液凝固儀)總體人群為<780 ng/mL，其中≤50歲男性為<650 ng/mL，>50歲男性為<802 ng/mL；≤50歲女性為<810 ng/mL，>50歲女性為<830 ng/mL。

2.4D-二聚體排除診斷VTE的臨界值和診斷性能 200例非VTE疾病對照組和200例VTE患者組以化學發(fā)光法測定的D-二聚體結(jié)果分別為2 344(205，10 123) ng/mL FEU和2 525(509，13 734)ng/mL FEU，以免疫比濁法測定的D-二聚體結(jié)果分別為2 490(327，14 249)ng/mL DDU和3 156(636，17 168)ng/mL DDU。將VTE組、非VTE疾病對照組患者的D-二聚體檢測結(jié)果與健康人數(shù)據(jù)置于同一數(shù)據(jù)集內(nèi)，用ROC曲線分析2種方法對VTE的排除診斷性能，見表3。

表3 2種D-二聚體檢測方法排除診斷VTE的ROC曲線分析結(jié)果

3 討論

D-二聚體是排除診斷靜脈血栓和監(jiān)測血栓風險的重要指標，廣泛應(yīng)用于臨床各個學科。作為一種纖維蛋白降解產(chǎn)物，D-二聚體片段有很強的異質(zhì)性，使得不同試驗方法檢出的D-二聚體類型差異較大，至今尚未實現(xiàn)標準化，其測定結(jié)果有ng/mL、μg/mL和mg/L等多種報告方式，且結(jié)果定義也不一致(包括FEU和DDU 2種形式)，因此源自不同方法學的數(shù)據(jù)不能進行相互換算和橫向比對[5]。

基于既往資料，D-二聚體數(shù)據(jù)屬于偏態(tài)分布，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)關(guān)于參考值設(shè)定的C28-A2文件，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)在制定參考值時，樣本數(shù)量應(yīng)多于正態(tài)分布數(shù)據(jù)(≥100例)，采用百分位數(shù)法，以增高為異常。本研究中的各個年齡段均納入>198個觀察個體，其中各年齡段內(nèi)的性別亞組均納入>100例觀察個體，可以滿足計算95%百分位數(shù)上側(cè)界值的要求。

既往研究發(fā)現(xiàn)，老年人的血漿D-二聚體水平高于青壯年人群[4-6]，本研究再次驗證了這一現(xiàn)象。結(jié)果顯示，化學發(fā)光法和免疫比濁法的D-二聚體檢測結(jié)果均表現(xiàn)出隨年齡逐漸增高的特點，且各年齡段的多組間比較顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，其中20～30歲組D-二聚體水平與31～40歲組差異無統(tǒng)計學意義，表明20～40歲健康人群的止凝血功能狀態(tài)相對穩(wěn)定，上述特征在2個檢測系統(tǒng)、不同性別人群中表現(xiàn)一致。

在20～30歲組、31～40歲組、41～50歲組、51～60歲組中，女性的血漿D-二聚體水平都高于男性且差異有統(tǒng)計學意義?；瘜W發(fā)光法檢測總體人群參考值為<528 ng/mL，在≤50歲人群和>50歲人群中，女性參考值(< 441 ng/mL和<673 ng/mL)均高于男性(<271 ng/mL和<637 ng/mL)；免疫比濁法的參考值特征也表現(xiàn)出相同的趨勢，總體人群參考值為<780 ng/mL，女性參考值(810 ng/mL和830 ng/mL)高于男性(650 ng/mL和802 ng/mL)，其原因可能與雌激素水平相關(guān)[7-9]。

此外，在≥61歲組，男、女性別間的差異無統(tǒng)計學意義，則進一步提示隨年齡增長，導致凝血活化的因素逐漸增多，D-二聚體水平隨之增高，在高齡人群中，血漿D-二聚體濃度可能受到基于血管因素和血液流動力學的多方面影響，從而掩蓋了性別間的水平差異。需注意，雖然2種實驗方法的測定結(jié)果均顯示出現(xiàn)血漿D-二聚體濃度隨年齡增高的現(xiàn)象，但二者在各年齡段的趨勢特征有所不同，例如化學發(fā)光法的D-二聚體水平在51～60歲與≥61歲的女性人群比較中差異有統(tǒng)計學意義，但在免疫比濁法的數(shù)據(jù)中則無統(tǒng)計學意義。本研究認為其原因可能與2種方法所檢出的不同D-二聚體片段在血漿中濃度存在差異有關(guān)，同時也不能排除是來自不同亞組人群樣本所造成的誤差，因此尚需更多臨床觀察進行驗證。

既往研究表明，血漿D-二聚體濃度隨年齡增加會降低其排除診斷VTE的特異性，因此對于50歲以上的低度VTE臨床可能性患者，宜采用“年齡×10 ng/mL”的方式上調(diào)臨界值以提高診斷性能(在維持高敏感性的基礎(chǔ)上，提高特異性)[6-11]，2014年《歐洲心臟病學會(European Society of Cardiology，ESC)急性肺栓塞診斷和用藥指南》[12]、2018年《中國血栓性疾病防治指南》[1]、《肺血栓栓塞癥診治與預防指南》[2]、2019年《ESC急性肺栓塞診斷和用藥指南》[13]均推薦該模式用于VTE的排除診斷。ROC分析顯示，2種D-二聚體檢測方法在各年齡段人群中，VTE排除診斷的臨界值均隨年齡增加而提高，且都有很好的敏感性和陰性預測值(但診斷敏感性在高齡人群中有所降低)，并保持相對穩(wěn)定的特異性和陽性預測值，這一特征與既往其他方法學研究一致[6-11]，實驗室應(yīng)結(jié)合自身技術(shù)平臺、患者群以及疾病分布特征制定適合本醫(yī)療機構(gòu)的臨界值[1-2,14-16]。此外，由于不同方法檢測的D-二聚體在年齡變化趨勢上存在一定性別差異，提示臨床在評估數(shù)據(jù)的臨床意義時，應(yīng)事先了解本機構(gòu)實驗室的方法學類型。

綜上所述，雖然化學發(fā)光法與免疫比濁法在檢測原理、結(jié)果定義等方面有顯著差異，但二者在健康人群中的總體數(shù)據(jù)分布特征相近，對VTE排除診斷均具有高度敏感性和良好的陰性預測值，表明這2種方法可安全用于VTE的排除診斷。