淋病奈瑟菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展*

鄭曉麗，陳紹椿，尹躍平(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心，南京 210042)

淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,NG)感染而引起的一種常見(jiàn)的性傳播疾病。NG屬于奈瑟菌屬，人類是其唯一天然宿主，可引起泌尿生殖道感染(如尿道炎、宮頸炎等)和泌尿生殖道外感染(如直腸炎、咽炎、眼炎等)。淋病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要是病原學(xué)檢測(cè)，常用的傳統(tǒng)方法有顯微鏡檢查法和培養(yǎng)法，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測(cè)逐漸成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南推薦的方法之一。本文對(duì)傳統(tǒng)方法、分子生物學(xué)及其他方法的檢測(cè)特點(diǎn)進(jìn)行綜述，為臨床NG檢測(cè)方法的選擇提供參考。

1 傳統(tǒng)方法

1.1顯微鏡檢查法 顯微鏡檢查法是臨床上NG檢測(cè)的傳統(tǒng)方法之一。在有尿道炎癥狀的男性患者中，革蘭染色直接鏡檢敏感性可達(dá)95%，特異性可達(dá)97%[1]，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)多形核白細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌時(shí)，具有診斷價(jià)值[2]。在男性無(wú)癥狀尿道感染患者和女性患者中，直接鏡檢敏感性及特異性均較低。咽部存在與NG同奈瑟菌屬的其他共生菌，形態(tài)與NG相同，鏡檢的特異性較低。因此，對(duì)于泌尿生殖道外感染的檢測(cè)，應(yīng)采用細(xì)菌培養(yǎng)等方法。

1.2培養(yǎng)法 培養(yǎng)法有較高的敏感性和特異性，是NG實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。對(duì)女性患者、無(wú)癥狀感染者和判愈試驗(yàn)都有較高敏感性。此外，細(xì)菌培養(yǎng)還可進(jìn)一步用于檢測(cè)抗菌藥物的敏感性。

影響細(xì)菌培養(yǎng)敏感性的因素主要包括取材部位、標(biāo)本運(yùn)輸、判斷標(biāo)準(zhǔn)選擇及患者人群等。對(duì)于泌尿生殖道標(biāo)本，即時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)有較好的敏感性。Walsh等[4]發(fā)現(xiàn)對(duì)泌尿生殖道標(biāo)本，培養(yǎng)敏感性為100%；Goh等[5]的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在女性宮頸NG感染中，培養(yǎng)陽(yáng)性率為93.6%；在女性尿道NG感染中，培養(yǎng)陽(yáng)性率為94.8%。對(duì)泌尿生殖道外標(biāo)本，培養(yǎng)的敏感性較低。部分不具備培養(yǎng)能力的臨床實(shí)驗(yàn)室可將標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)至其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，但長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸會(huì)影響NG活性使培養(yǎng)陽(yáng)性率下降[6]。Harryman等[7]報(bào)道了運(yùn)輸標(biāo)本培養(yǎng)的敏感性，以核酸檢測(cè)陽(yáng)性和培養(yǎng)陽(yáng)性為真陽(yáng)性，有癥狀男性尿道標(biāo)本培養(yǎng)的敏感性為79%，無(wú)癥狀男性為29%；有癥狀男性直腸部位標(biāo)本培養(yǎng)的敏感性為55%，無(wú)癥狀男性44%；有癥狀女性生殖道部位標(biāo)本培養(yǎng)敏感性為 53%，無(wú)癥狀女性47%。NG是苛養(yǎng)菌，對(duì)干燥、寒冷、熱和消毒劑均敏感，因此標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)需注意保溫保濕，立即送培養(yǎng)，或在轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基接種后送培養(yǎng)。

培養(yǎng)后的菌株通常采用生化反應(yīng)進(jìn)一步鑒定，NG氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，能分解葡萄糖，不分解麥芽糖、蔗糖、乳糖，可以此和其他奈瑟菌進(jìn)行鑒別，或是用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2 分子生物學(xué)方法

NG檢測(cè)的分子生物學(xué)方法主要包括核酸檢測(cè)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)。

2.1核酸檢測(cè) 核酸檢測(cè)方法包括核酸雜交試驗(yàn)和核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(nucleic acid amplification tests, NAATs)兩大類。核酸檢測(cè)速度快、敏感性高，對(duì)標(biāo)本保存和轉(zhuǎn)運(yùn)條件要求低，檢測(cè)結(jié)果可不受NG存活狀態(tài)的影響，且NAATs可以采用非侵入性取材標(biāo)本(尿液或陰道拭子等)。

2.1.1核酸雜交試驗(yàn) 核酸雜交試驗(yàn)使用標(biāo)記的DNA探針來(lái)識(shí)別微生物的特定核酸序列，不擴(kuò)增目的基因，需使用直接從尿道或?qū)m頸內(nèi)采集的拭子[8]。核酸雜交試驗(yàn)對(duì)標(biāo)本的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)要求沒(méi)有細(xì)菌培養(yǎng)嚴(yán)格，標(biāo)本可在室溫下7 d內(nèi)保持穩(wěn)定[9]。但其敏感性低，隨著NAATs方法的出現(xiàn)，核酸雜交試驗(yàn)在臨床已經(jīng)很少應(yīng)用。

2.1.2NAATs NAATs方法通過(guò)擴(kuò)增NG特異性基因片段檢測(cè)NG，主要采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)，亦有采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(transcription mediated amplification，TMA)、鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)等檢測(cè)。目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于NG檢測(cè)的使用較多的試劑盒有基于實(shí)時(shí)熒光PCR的Cobas 4800 CT/NG(Roche公司)、Real Time CT/NG(Abbott公司)、CT/NG Xpert(Cepheid公司)、MAX GC、MAX CT/GC、MAX CT/GC/TV(BD公司)，基于TMA的Aptima Combo 2(Hologic公司)，基于SDA的Probetec ET(BD公司)和Probetec GC Qx(BD公司)，以及使用普通PCR的Amplicor(Roche公司)。binx io CT/NG Assay(binx health公司)是首個(gè)經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于床旁檢測(cè)的試劑盒，可在30 min獲得結(jié)果[1]。Cepheid Xpert CT/NG和Roche Cobas 4800 CT/NG已在國(guó)內(nèi)注冊(cè)。國(guó)內(nèi)亦有大量注冊(cè)的用于NG核酸檢測(cè)的試劑盒，其主要采用PCR熒光探針?lè)ā晒釶CR和RNA恒溫?cái)U(kuò)增法。單次NAATs的敏感性隨采用的擴(kuò)增技術(shù)(PCR、SDA、TMA)、標(biāo)本來(lái)源和類型的不同而異。

NAATs敏感性高，可檢測(cè)多種泌尿生殖道標(biāo)本，包括尿液標(biāo)本(來(lái)自男性和女性)、陰道拭子和宮頸拭子，首選標(biāo)本是男性晨尿和女性陰道拭子[10]。女性不管有無(wú)癥狀，NAATs對(duì)生殖道部位標(biāo)本敏感性均很高[7]。Gaydos等[11]報(bào)道，對(duì)女性患者，NAATs檢測(cè)陰道拭子與宮頸拭子敏感性均為100%，而檢測(cè)尿液標(biāo)本的敏感性(95.6%)略低于前兩者。對(duì)男性患者尿道標(biāo)本，不管患者有無(wú)癥狀，NAATs檢測(cè)的敏感性均很高，有癥狀男性的NAATs檢測(cè)敏感性達(dá)99%，無(wú)癥狀男性檢測(cè)敏感性為94%[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，NAATs在泌尿生殖道標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率高于培養(yǎng)法[12-13]。王勤婉等[13]檢測(cè)1 491份泌尿生殖道標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)PCR熒光探針?lè)?6.64%)的陽(yáng)性檢出率高于培養(yǎng)法(4.16%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

一些研究已證實(shí)，NAATs檢測(cè)泌尿生殖道外部位(如口咽部和直腸)標(biāo)本的敏感性顯著高于培養(yǎng)[4,7]。NAATs檢測(cè)泌尿生殖道外部位淋病的問(wèn)題主要是特異性，因?yàn)槊谀蛏车劳獠课挥蟹侵虏⌒阅紊嬖?，可能存在交叉反?yīng)。Tabrizi等[14]評(píng)估6種(Gen-Probe Aptima Combo 2 和 Aptima GC，Roche Cobas Amplicor CT/NG和Cobas 4800 CT/NG，BD ProbeTec GC Qx，Abbott Real Time CT/NG)NAATs對(duì)450株臨床株(包括216株NG、218株非NG性奈瑟菌和16株密切相關(guān)的非奈瑟菌)的特異性，發(fā)現(xiàn)除Cobas Amplicor CT/NG有4株(1.9%)NG未鑒定出，其余均準(zhǔn)確鑒定了216株NG；在234株非NG分離株的鑒定中，由于交叉反應(yīng)，Cobas Amplicor和ProbeTec檢測(cè)假陽(yáng)性率最高，余4種假陽(yáng)性率較低，在重新培養(yǎng)菌落再次測(cè)定后，Aptima Combo 2、Abbott Real Time和Cobas 4800的檢測(cè)結(jié)果中無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果存在。隨后，Golparian等[15]對(duì)Aptima Combo 2和Aptima GC檢測(cè)展開(kāi)研究，在檢測(cè)的205株NG和298株非NG菌株中，由于污染亦有假陽(yáng)性結(jié)果的存在，在排除污染重新培養(yǎng)，稀釋后再測(cè)定，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果，敏感性和特異性均為100%，表明NAATs檢測(cè)的準(zhǔn)確性的提高需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制(陽(yáng)性和陰性質(zhì)控以及環(huán)境質(zhì)控)、排除污染和設(shè)置合適的參數(shù)。目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)Aptima Combo 2(Hologic公司)和CT/NG Xpert(Cepheid公司)用于檢測(cè)咽部和直腸部位標(biāo)本。WHO和美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦在診斷直腸和咽部NG感染時(shí)優(yōu)先選擇NAATs[10，16]。截至2020年7月，我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上注冊(cè)的NAATs檢測(cè)方法僅用于泌尿生殖道NG感染檢測(cè)。

核酸檢測(cè)的另一優(yōu)勢(shì)是患者自采標(biāo)本與臨床醫(yī)生采集標(biāo)本也有較好的一致性。自采和醫(yī)生采集的宮頸陰道拭子敏感性相當(dāng)(Cobas 6800/8800)[17]，自采和醫(yī)生采集的直腸拭子檢測(cè)NG的敏感性分別為77%和68%(ProbeTec)、84%和78%(Aptima Combo 2)[18]，自采和醫(yī)生采集的咽部標(biāo)本之間的一致性為96.6%(Aptima Combo 2)[19]。

NAATs能夠快速獲得結(jié)果，敏感性高，對(duì)標(biāo)本的留取要求相對(duì)低，可非侵入性取材，但是NAATs試劑和儀器設(shè)備相對(duì)昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高，必須嚴(yán)格把控操作過(guò)程，且存在一定的假陽(yáng)性率。此外，NAATs無(wú)法進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要加以選擇。

2.2MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離質(zhì)譜，是一種快速而強(qiáng)大的檢測(cè)工具，廣泛應(yīng)用于病原微生物的鑒定。

Buchanan等[20]分別用MALDI-TOF MS和API NH生化方法對(duì)1 090株常規(guī)臨床標(biāo)本分離株進(jìn)行NG鑒定，其中1 082株被API NH鑒定為NG；MALDI-TOF MS首次分析后成功鑒定984份(91%)，二次分析后1 081份(99.9%)被成功鑒定，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為99.3%。首次鑒定失敗的分離株中，76%因?yàn)闊o(wú)法產(chǎn)生可識(shí)別的蛋白質(zhì)指紋圖譜，24%因?yàn)槌跏艰b定為非NG。Morel等[21]評(píng)估了Bruker Biotyper和Andromas對(duì)88株NG、18株腦膜炎奈瑟菌和29株共生奈瑟菌的鑒定能力，這2個(gè)系統(tǒng)均正確鑒定了88株NG。但是，Pandey等[22]報(bào)道咽部標(biāo)本培養(yǎng)后使用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定，使用Bruker公司RUO MALDI Biotyper、MALDI Biotyper CA和CDC MicrobeNet均首先鑒定為NG，而16S rRNA測(cè)序示N.meningitidis/N.cinerea。因此，在使用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照流程操作，在解讀存在奈瑟菌屬共生菌部位的結(jié)果時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，必要時(shí)聯(lián)合其他檢測(cè)方法進(jìn)一步確證。

MALDI-TOF MS檢測(cè)NG單個(gè)反應(yīng)成本較低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速，但需要對(duì)培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行鑒定，檢測(cè)的準(zhǔn)確性依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)中菌種的信息量和可靠性，需要進(jìn)一步完善其數(shù)據(jù)庫(kù)并臨床評(píng)估其準(zhǔn)確性。

3 其他檢測(cè)方法

目前已有一些床旁檢測(cè)方法用于淋病的快速診斷，如抗原檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)的NG抗原檢測(cè)商品化試劑盒僅用于女性宮頸分泌物、男性尿道分泌物標(biāo)本中的NG抗原的篩查，但NG表面抗原變異大，國(guó)外報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示其敏感性和特異性較低[23]。此外，還有報(bào)道采用干化學(xué)酶法進(jìn)行NG的檢測(cè)[24]，但是國(guó)內(nèi)外目前對(duì)此方法評(píng)價(jià)報(bào)道少。以上床旁檢測(cè)方法在臨床中的檢測(cè)價(jià)值還需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

4 小結(jié)

對(duì)不同人群、不同部位NG感染應(yīng)選擇相應(yīng)敏感性和特異性均較高的檢測(cè)方法(見(jiàn)圖1)。對(duì)有尿道炎癥狀男性患者推薦首選顯微鏡檢查法。細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)即時(shí)采樣檢測(cè)標(biāo)本的敏感性和特異性相對(duì)較高，仍是目前所推薦的“金標(biāo)準(zhǔn)”。NAATs具有高敏感性、高特異性、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，且可非侵入性取材(如尿液標(biāo)本)，標(biāo)本運(yùn)輸方便，最新指南已列為淋病的常規(guī)檢測(cè)手段之一。但是生殖道以外標(biāo)本NAATs與其他共生奈瑟菌可能存在交叉反應(yīng)，因此應(yīng)謹(jǐn)慎解讀存在共生奈瑟菌部位的NAATs陽(yáng)性結(jié)果，必要時(shí)采用另一種方法確證。MALDI-TOF MS檢測(cè)NG每個(gè)反應(yīng)成本較低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速，但其需要對(duì)培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行鑒定，且方法的準(zhǔn)確性依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)的完善和臨床評(píng)估驗(yàn)證。NG抗原變異大，目前的抗原檢測(cè)方法需進(jìn)一步大樣本的臨床評(píng)估。