產(chǎn)KPC型碳青霉烯類耐藥腸桿菌對頭孢他啶-阿維巴坦的體外敏感性變化的機(jī)制分析*

崔曉燕，聞奕丞，徐穎，皇甫芷如，方芊芊，張雅昕，杜鴻(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215004)

近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床治療中的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)感染比例不斷增加。CRE耐藥的主要機(jī)制為編碼產(chǎn)生能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物的碳青霉烯酶[1]。其中，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)是目前世界上流行最為廣泛的碳青霉烯酶，尤其是在中國[2]。阿維巴坦(avibactam，AVI)是一種非β-內(nèi)酰胺類的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，能夠有效抑制KPC、OXA-48、AmpC等絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶的水解活性，但對NDM、IMP、VIM等金屬β-內(nèi)酰胺酶無抑制作用[3]。傳統(tǒng)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與AVI組合，能夠明顯擴(kuò)大抑菌活性范圍。2015年，美國食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)將頭孢他啶-阿維巴坦(ceftazidime-avibactam，CAZ-AVI)用于臨床治療[4]。2019年5月，中國正式批準(zhǔn)將注射制劑CAZ-AVI (ZAVICEFTA?)應(yīng)用于臨床治療多重耐藥革蘭陰性菌引起的復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染以及醫(yī)院獲得性肺炎，包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎。

本次研究收集蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院非重復(fù)CRE臨床菌株，旨在檢測未接受過CAZ-AVI治療的產(chǎn)KPC型CRE(KPC-producing CRE，KPC-CRE)對CAZ-AVI的體外敏感性，研究產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌(KPC-producingKlebsiellapneumoniae，KPC-KP)對CAZ-AVI敏感性降低機(jī)制，為CAZ-AVI在該醫(yī)院臨床治療CRE感染中的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦腸桿菌耐藥折點(diǎn)[5]，以腸桿菌中碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南或美羅培南)最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)>2 mg/L(使用Phoenix-100 全自動細(xì)菌鑒定儀配套藥敏板卡進(jìn)行測定)，同時(shí)K-B法復(fù)核美羅培南抗菌藥物紙片抑菌圈直徑≤14 mm為CRE納入標(biāo)準(zhǔn)；使用Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)PCR擴(kuò)增16S rRNA[6]，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物及擴(kuò)增引物送至上海生工生物公司使用ABI測序儀(3730xl DNA Analyzer)進(jìn)行Sanger測序，并將測序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行比對，從而驗(yàn)證菌種。

回顧性收集2016年10月—2018年6月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院分離保存的所有非重復(fù)CRE臨床菌株共計(jì)70株，包括肺炎克雷伯菌47株、大腸埃希菌10株、產(chǎn)酸克雷伯菌8株、產(chǎn)氣腸桿菌3株、陰溝腸桿菌和黏質(zhì)沙雷菌各1株；其中46株(65.7%)分離自呼吸道，10株(14.3%)分離自泌尿道，5株(7.1%)分離自血液，5株(7.1%)分離自腹腔，4株(5.8%)分離自其他部位。

實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，其中碳青霉烯酶基因、ESBLs基因、外膜蛋白基因檢測及藥敏試驗(yàn)陰性質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC 25922；產(chǎn)碳青霉烯酶表型檢測陰性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706，陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；碳青霉烯酶基因檢測陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌1192(blaKPC)、大腸埃希菌1202(blaNDM)、肺炎克雷伯菌2334(blaIMP)、霍氏腸桿菌0867(blaVIM)和肺炎克雷伯菌1923(blaOXA-48)；ESBLs基因檢測陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌1188(blaCTX-M)、肺炎克雷伯菌1182(blaTEM)和肺炎克雷伯菌1507(blaSHV)；外膜蛋白基因檢測陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌1320(ompK35)和肺炎克雷伯菌1208(ompK36)；CAZ-AVI藥敏試驗(yàn)陽性質(zhì)控菌為大腸埃希菌1202。

1.2主要儀器與試劑 Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀及配套藥敏板卡、瓊脂糖凝膠核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)分析儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，麥?zhǔn)媳葷醿x(法國生物梅里埃公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、CAMHB肉湯(美國Oxoid公司)，瓊脂粉(美國VETEC公司)，瓊脂糖凝膠粉(西班牙BIOWEST公司)，DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(日本TaKaRa公司)，DNA純化試劑盒(美國AXYGEN公司)，美羅培南、頭孢他啶(干粉，中國BIOSHARP公司)，阿維巴坦(德國LKT公司)，生理鹽水、氯化鈉、氯仿、異丙醇、甘油(國藥集團(tuán))，TRIZOL試劑(美國Ambion公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)，SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)。

1.3藥敏試驗(yàn)

1.3.1臨床常見抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 用Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀配套的革蘭陰性菌藥敏板測定CRE臨床菌株對臨床常見抗菌藥物的MIC值。藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI[5]和EUCAST(莫西沙星)[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.3.2CAZ-AVI藥物敏感性試驗(yàn) 用微量肉湯稀釋法測定CAZ-AVZ對KPC-CRE的MIC值。用生理鹽水調(diào)整待測菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，隨后繼續(xù)用生理鹽水將上述菌懸液稀釋30倍；用CAMHB液體培養(yǎng)基將CAZ原液(濃度為1 280 mg/L)倍比稀釋至5 mg/L；取等體積AVI原液(濃度為160 mg/L)加入每個(gè)稀釋的CAZ管中；用CAMHB液體培養(yǎng)基1∶10稀釋每管CAZ-AVI；取等體積菌懸液加入每個(gè)稀釋的CAZ-AVI管中，則最終藥物濃度為32/4 mg/L、16/4 mg/L、8/4 mg/L、4/4 mg/L、2/4 mg/L、1/4 mg/L、0.5/4 mg/L、0.25/4 mg/L、0.125/4 mg/L[5]。以ATCC 25922為陰性對照(同時(shí)測定CAZ MIC值)，以1202為陽性對照，以不加入藥物組為生長對照，以不加入藥物和菌株組為空白對照。將上述體系置于37 ℃培養(yǎng)16～20 h后，無細(xì)菌生長管的CAZ-AVI(或CAZ)最低濃度即其MIC。當(dāng)陰性對照CAZ MIC≤0.5 mg/L且CAZ-AVI MIC≤0.5/4 mg/L、陽性對照CAZ-AVI MIC≥16/4 mg/L、生長對照管全部渾濁且空白對照管全部澄清時(shí)，待測菌CAZ-AVI MIC結(jié)果可信，藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行判讀。

本次研究采用已報(bào)道過的CAZ-AVI敏感性降低菌株MIC cut-off值[8]，將CAZ-AVI MIC≥4/4 mg/L的菌株定義為CAZ-AVI敏感性降低菌株。

1.4產(chǎn)碳青霉烯酶表型檢測 采用改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)(mCIM)，根據(jù)CLSI檢測步驟[5]，同時(shí)設(shè)置浸沒于無菌TSB肉湯的美羅培南抗菌藥物紙片和干燥的美羅培南抗菌藥物紙片作為空白對照；設(shè)置浸沒于肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705菌懸液的美羅培南抗菌藥物紙片為陽性對照；設(shè)置浸沒于肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706菌懸液的美羅培南抗菌藥物紙片為陰性對照。對所收集的CRE菌株進(jìn)行產(chǎn)碳青霉烯酶表型檢測，檢測結(jié)果根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行判讀。

1.5耐藥相關(guān)基因的檢測 用PCR法擴(kuò)增產(chǎn)碳青霉烯酶表型試驗(yàn)陽性CRE菌株中常見的碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48。使用文獻(xiàn)[9]中引物序列，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行引物合成。PCR反應(yīng)體系共15 μL，包括模板DNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×PCR mixture 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀顯影。當(dāng)陰性對照泳道無條帶，實(shí)驗(yàn)菌株泳道出現(xiàn)清晰單一且與陽性對照泳道位置相同的條帶時(shí)即判為陽性。

隨機(jī)選取5株CAZ-AVI MIC≤2/4 mg/L的ST11型KPC-KP菌株組成敏感對照組，用PCR法擴(kuò)增CAZ-AVI敏感性降低菌株及敏感菌株中blaKPC、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因blaCTX-M、blaTEM和blaSHV以及外膜蛋白基因ompK35、ompK36。用文獻(xiàn)[10-12]中引物序列，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行引物合成。PCR反應(yīng)體系共15 μL，包括模板DNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×PCR mixture 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。電泳分析如上所述。

將擴(kuò)增產(chǎn)物及擴(kuò)增引物送至上海生工生物公司用3730xl DNA測序儀(ABI公司)進(jìn)行Sanger測序，并將測序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行比對。

1.6多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 用PCR法擴(kuò)增KPC-CRE中高度保守的管家基因，包括rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB(克雷伯菌屬)和dnaA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB、rpoB(腸桿菌屬細(xì)菌)。用文獻(xiàn)[13-14]中引物序列，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行引物合成。PCR反應(yīng)體系共15 μL，包括模板DNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×PCR mixture 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用上述Sanger測序的方法，序列結(jié)果上傳至MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://pubmlst.org/)獲得等位基因編號，組合等位基因編號進(jìn)而查得序列分型(sequence type，ST)結(jié)果。

1.7CAZ-AVI敏感性降低菌株中blaKPC的相關(guān)檢測

1.7.1blaKPC相對拷貝數(shù) 挑取5個(gè)CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP單克隆菌落，組成敏感性降低實(shí)驗(yàn)組；以上述5株CAZ-AVI MIC≤2/4mg/L的KPC-KP菌株為敏感對照組；以rpoB為內(nèi)參基因。煮沸法提取并處理菌株基因組[15]；使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)blaKPC及rpoB特異性引物序列見表1，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行引物合成。用qRT-PCR擴(kuò)增每株菌中blaKPC及rpoB基因，反應(yīng)體系共20 μL，包括模板DNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，56 ℃退火/延伸5 s，35個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△Ct計(jì)算得到每株菌中blaKPC相對拷貝數(shù)。

1.7.2blaKPC相對表達(dá)量 用TRIZOL法提取上述2組菌株總RNA；用試劑盒中隨機(jī)引物配制逆轉(zhuǎn)錄體系，使用PCR儀設(shè)置程序25 ℃ 5 min，隨后42 ℃ 60 min，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用表1中特異性引物，根據(jù)1.7.1中反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)2-△Ct計(jì)算得到每株菌中blaKPC相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物

1.7.3blaKPC啟動子分析 根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]，參照GenBank中FJ628167序列，設(shè)計(jì)blaKPC的上游啟動子區(qū)域引物KPCpro-F(5′-AACGGTCGTATCAGCG

ACAT-3′)和KPCpro-R(5′-CGAGTTTAGCGAATGGT

TCC-3′)，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行引物合成。PCR擴(kuò)增CAZ-AVI敏感性降低菌株中blaKPC的上游啟動子區(qū)域，反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)與1.5中碳青霉烯酶基因檢測相同，并采用1.5中所述方法進(jìn)行Sanger測序及序列比對分析。

1.7.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism 5.0軟件，每株菌作3組平行對照，blaKPC相對拷貝數(shù)和相對表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Welch′st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CRE菌株對臨床常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果 所收集的CRE菌株對亞胺培南耐藥率達(dá)98.6%，對美羅培南耐藥率為81.4%，另外對本次研究檢測的所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率均較高(>80%)，其中哌拉西林以及頭孢菌素類抗菌藥物耐藥率>90%；此外，大多數(shù)CRE菌株(>90%)對β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物耐藥。見表2。多數(shù)CRE菌株(>60%)對氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物耐藥，但其耐藥率較β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物及β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制復(fù)合物耐藥率低。

表2 CRE菌株對臨床常見抗菌藥物的耐藥率[n(%)]

2.2CRE菌株產(chǎn)碳青霉烯酶表型檢測 70株CRE菌株中有49株(70.0%)產(chǎn)碳青霉烯酶表型陽性，為產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE)。其中42株抑菌圈直徑為6 mm，其余7株抑菌圈直徑為7～14 mm。CPE菌種分布見表3。

2.3產(chǎn)碳青霉烯酶表型陽性菌株中KPC-CRE菌株的篩選 PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sanger測序及比對，結(jié)果顯示正確率達(dá)100%。49株產(chǎn)碳青霉烯酶表型陽性菌株中，blaKPC陽性26株(占53.1%)，即檢測到KPC-CRE 26株，其中包括肺炎克雷伯菌25株(占96.2%)和產(chǎn)氣腸桿菌1株(占3.8%)，且上述菌株未同時(shí)攜帶金屬類碳青霉烯酶基因。見表3。碳青霉烯酶基因檢測部分電泳結(jié)果見圖1。

表3 產(chǎn)碳青霉烯酶表型陽性CRE菌株碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

2.4KPC-CRE菌株ST分型 經(jīng)MLST測序比對，KPC-CRE中25株肺炎克雷伯菌分屬于2種ST分型，其中ST11型23株(92.0%)，ST12型2株(8.0%)；1株產(chǎn)氣腸桿菌屬于ST418型。

2.5CAZ-AVI體外抑制KPC-CRE的MIC測定 KPC-CRE對CAZ-AVI的敏感率為100%(MIC≤4/4 mg/L)，其中MIC50為1/4 mg/L，MIC90為2/4 mg/L。見表4。根據(jù)CAZ-AVI敏感性降低菌株MIC cut-off值(CAZ-AVI MIC≥4/4 mg/L)，本次研究篩選出1株CAZ-AVI敏感性降低ST11型KPC-KP(MIC 4/4 mg/L)。

表4 CAZ-AVI對KPC-CRE MICs測定結(jié)果

2.6耐藥相關(guān)基因檢測 CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP中攜帶野生型blaKPC-2以及2種ESBLs基因blaCTX-M-65和blaTEM-1，部分電泳結(jié)果見圖2。此外，外膜蛋白基因ompK35/36均檢測到突變，其中ompK35第82位A堿基缺失，造成早期移碼突變，導(dǎo)致OmpK35在第63位氨基酸發(fā)生提前終止，最終導(dǎo)致OmpK35缺失；ompK36具有完整的編碼框，但OmpK36第134位氨基酸后存在甘氨酸-天冬氨酸的插入(134-135 GD)，最終導(dǎo)致OmpK36功能缺陷。

CAZ-AVI敏感KPC-KP中均攜帶野生型blaKPC-2以及數(shù)量不等的ESBLs基因，并且外膜蛋白基因型與CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP相同。

2.7CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP中blaKPC的相關(guān)檢測 qRT-PCR結(jié)果顯示，CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP中blaKPC的相對拷貝數(shù)(3.167±0.011 8，n=5)為對照組(1.879±0.166 7，n=5)的1.69倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001 5)；相對表達(dá)量(7.724±0.027 5，n=5)為對照組(2.624±0.182 9，n=5)的2.94倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；PCR結(jié)合Sanger測序比對結(jié)果顯示，CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP中blaKPC-2啟動子區(qū)域未檢測到突變。

3 討論

目前，中國是全球范圍內(nèi)CRE流行率較高的國家[17]。2018年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CARSS)報(bào)告顯示，近五年全國CRE檢出率持續(xù)上升。其中，肺炎克雷伯菌檢出率最高且持續(xù)增加，其檢出率在2013年—2018年由4.9%上升至10.1%(http://www.carss.cn/)。肺炎克雷伯菌攜帶的主要碳青霉烯酶基因?yàn)閎laKPC[1]。本次研究結(jié)果顯示，本院CRE中檢出率最高的同樣為肺炎克雷伯菌(67.2%)，其中主要為克隆性傳播的ST11型KPC-KP。所收集的大多數(shù)CRE菌株對臨床常用的抗菌藥物耐藥，因此臨床治療需要更優(yōu)選擇。

CAZ與AVI組合，能夠明顯擴(kuò)大其抑菌活性范圍。針對我國未接受過CAZ-AVI治療的KPC-CRE菌株，有研究顯示，CAZ-AVI的MIC50為2/4 mg/L，MIC90為4/4 mg/L[8]。而本次研究結(jié)果顯示本院KPC-CRE對CAZ-AVI的MIC50為1/4 mg/L，MIC90為2/4 mg/L，均低于上述研究結(jié)果，且敏感率為100%，表明CAZ-AVI對本院分離的KPC-CRE菌株具有很強(qiáng)的抑制作用，提示臨床可以將CAZ-AVI作為治療KPC-CRE的新選擇。

本次研究篩選出1株CAZ-AVI敏感性降低的KPC-KP，并且其攜帶的blaKPC-2中未檢測到突變，提示存在其他機(jī)制導(dǎo)致菌株對抗菌藥物敏感性下降。有研究顯示，對CAZ的高水解活性及外膜蛋白OmpK35缺失會導(dǎo)致CAZ-AVI對菌株的MIC值升高[8]。在本次研究中，CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP和CAZ-AVI敏感KPC-KP均攜帶ESBLs基因，并且合并外膜蛋白OmpK35的缺失及OmpK36的功能缺陷，因此提示敏感性降低的機(jī)制可能是blaKPC-2拷貝數(shù)和/或表達(dá)量增加。其中，blaKPC-2的高拷貝可能是由于菌株中攜帶多個(gè)編碼blaKPC-2的質(zhì)粒[18]或攜帶blaKPC-2的質(zhì)粒中存在相關(guān)移動元件的多拷貝[19]；blaKPC-2啟動子區(qū)域未檢測到突變，因此blaKPC-2的高表達(dá)量可能是blaKPC-2的高拷貝或其他調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院分離的KPC-CRE主要為克隆性傳播的ST11型KPC-KP；CAZ-AVI對未接受過該藥物治療的KPC-CRE具有很強(qiáng)的體外抑制作用，可為臨床治療相關(guān)細(xì)菌感染提供新的選擇；blaKPC-2拷貝數(shù)和/或表達(dá)量增加可能會導(dǎo)致KPC-KP對CAZ-AVI敏感性降低。