抗凝血酶Ⅲ評價HBV感染相關(guān)慢加急性肝衰竭患者疾病進(jìn)展和28天死亡率的應(yīng)用價值*

吳曉娟，趙文玲，蘇真珍，黃珣鋇，袁宇珊，魏彬，王蘭蘭，蔡蓓(四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，成都 610041)

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是指在慢性肝病/肝硬化基礎(chǔ)上的急性肝損傷，起病急，可引起多器官衰竭，短期死亡率高，預(yù)后較差[1],不同于失代償性肝硬化及急性肝衰竭類綜合征。ACLF可由多種因素引起，病情進(jìn)展迅速并以伴隨患者短期高死亡率為主要特點。已有研究表明，ACLF患者90 d死亡率常常超過50%[2]。因此，對患者進(jìn)行早期診斷與積極治療以降低患者死亡率是現(xiàn)今臨床研究中關(guān)注的熱點與難點。

抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)是由肝細(xì)胞合成的具有抑制凝血功能的糖蛋白，70%～80%的凝血酶由其滅活，其與凝血酶形成1∶1共價復(fù)合物而抑制凝血酶，并活化凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等絲氨酸蛋白酶活性，維持機體的出凝血平衡，是人體中重要的抗凝物質(zhì)之一[3]。嚴(yán)重肝病患者由于肝臟合成AT Ⅲ減少、消耗增多以及跨毛細(xì)血管流過率改變等原因，血漿AT Ⅲ活性明顯降低，合并彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)時降低更為顯著。有學(xué)者在通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究ALCF患者血漿中各蛋白質(zhì)組分中發(fā)現(xiàn)，AT Ⅲ在用于評價凝血功能狀態(tài)時具有較好的診斷價值[4]。目前臨床上有關(guān)AT Ⅲ指標(biāo)用于ACLF患者疾病進(jìn)展和預(yù)后判斷的相關(guān)報道較少。本研究回顧性分析和探討AT Ⅲ在評價HBV感染相關(guān)ACLF患者疾病進(jìn)展和28 d死亡率中的臨床應(yīng)用價值。

1 研究方法

1.1研究對象 納入2011年1月至2018年7月于四川大學(xué)華西醫(yī)院就診的HBV相關(guān)ACLF患者269例，HBV相關(guān)急性失代償性肝硬化(acute decompensated cirrhosis, AD)患者178例。慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg和/或HBV DNA陽性持續(xù)6個月以上[5]；ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)參考亞洲肝病協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)：在慢性肝病/肝硬化基礎(chǔ)上的急性肝損傷，表現(xiàn)為黃疸(血清膽紅素≥5 mg/dL)和凝血障礙[國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)≥1.5或凝血酶原活動度(PTA)<40%]，4周內(nèi)并發(fā)腹水和/或肝性腦病，并與高28 d死亡率相關(guān)[1]；AD診斷標(biāo)準(zhǔn)：肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的急性失代償事件(腹水、肝性腦病、黃疸、靜脈曲張破裂出血或細(xì)菌感染)[6]，且未發(fā)生或未達(dá)到ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并甲肝、丙肝、戊肝等肝臟相關(guān)病毒感染及合并HIV、梅毒等患者；合并肝臟及肝外相關(guān)腫瘤患者，合并肝臟相關(guān)其他疾病(如酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎等)患者；妊娠或哺乳期婦女；臨床信息或?qū)嶒炇倚畔⒉蝗摺Ｒ陨匣颊呔词褂萌斯じ沃委?，主要采用對癥治療和抗病毒治療，其中11例AD患者在住院期間發(fā)生ACLF。所有患者均進(jìn)行28 d內(nèi)的死亡情況隨訪。

1.2器官衰竭定義 各器官衰竭定義依據(jù)文獻(xiàn)[7]：肝衰竭指血清總膽紅素(T-Bil)≥12 mg/dL；凝血功能衰竭指標(biāo)INR≥2.5或血小板計數(shù)(PLT)≤20×109/L；腦衰竭為肝性腦?、蠹壖耙陨?；腎臟衰竭指血肌酐(Cr)≥2.0 mg/dL或使用腎臟替代療法；循環(huán)衰竭指平均動脈壓<60 mmHg或使用多巴胺、特利加壓素等治療；呼吸衰竭指SpO2/FiO2≤200。

1.3信息收集 回顧性收集患者臨床信息、患者入院時和治療5 d后實驗室指標(biāo)，包括T-Bil、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、清蛋白(Alb)、Cr、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)、纖維蛋白原(Fib)、D-二聚體(DD)、AT Ⅲ、INR、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)等。

1.4方法 T-Bil采用釩酸鹽法檢測(日本和光試劑)，ALT、AST和Cr采用酶法檢測(Roche公司試劑)，TP采用雙縮脲法檢測(Roche公司試劑)，Alb采用溴甲酚綠法檢測(Roche公司試劑)，CysC采用膠乳免疫比濁檢測(邁克公司試劑)，以上項目均在Roche cobas c702生化分析儀上檢測。WBC和PLT采用阻抗法在Sysmex XN 9100分析儀上用Sysmex公司試劑檢測。Fib、DD、APTT和TT均采用凝固法檢測(Siemens公司試劑)，AT Ⅲ采用發(fā)色底物法檢測(Siemens公司試劑)，以上凝血項目均在CS5100血凝儀(Sysmex公司)上檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 23.0和MedCalc 11.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組間差異比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)與四分位數(shù)[M(P25,P75)]描述，兩組間差異比較采用秩和檢驗Mann-WhitneyU法；計數(shù)資料比較用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法；ROC曲線分析各凝血指標(biāo)鑒別ACLF和AD的臨床價值或確定基線AT Ⅲ活性在預(yù)判ACLF患者28 d生存與否的最佳界值；用Kaplan-Meier法繪制ACLF患者28 d存活率的生存曲線，各組間生存率比較采用Log-Rank法；相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)分析；用MedCalc 11.4 軟件分析各指標(biāo)的ROC曲線下面積(AUCROC)鑒別診斷能力的統(tǒng)計學(xué)差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1納入患者臨床特征分析 兩組患者間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗室指標(biāo)、器官衰竭類型及28 d死亡率分析見表1。ACLF組患者肝臟功能、腎臟功能、凝血功能等明顯低于AD患者，其終末期肝臟評分、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值、慢性肝臟衰竭評分明顯高于AD組。在器官衰竭方面，AD并發(fā)各種器官衰竭的占比明顯低于ACLF患者。ACLF組短期死亡率顯著高于AD組。

表1 患者臨床基線資料分析

2.2AT Ⅲ在急性失代償性肝硬化和ACLF中的鑒別診斷價值 分析患者基線數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在AD生存組、AD死亡組、ACLF生存組、ACLF死亡組中，AT Ⅲ的活性逐漸降低，INR、APTT和TT逐漸延長，見表2。AT Ⅲ鑒別診斷AD和ACLF的AUCROC為0.906，僅次于INR(AUCROC=0.938)，見圖1。178例AD患者中，有11例進(jìn)展為ACLF，其AT Ⅲ基線水平顯著低于未發(fā)生ACLF的167例患者[36.2%(22.7%,49.3%)vs 47.8%(38.3%,61.4%)，P=0.021]。

表2 凝血指標(biāo)在失代償性肝硬化與慢加急性肝衰竭患者生存組與死亡組中的比較

2.3ACLF患者AT Ⅲ與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析及28 d死亡率分析 在ACLF患者中，AT Ⅲ活性與MELD評分(rs=-0.344,P=0.000)、CLIF-C ACLF評分(rs=-0.311,P=0.000)、CLIF-C OF評分(rs=-0.315,P=0.000)呈負(fù)相關(guān)。AT Ⅲ活性在凝血功能衰竭及腎衰竭患者中顯著降低，見圖2。根據(jù)ROC曲線的約登指數(shù)確定患者基線AT Ⅲ活性在鑒別診斷ACLF患者28 d生存與否的最佳臨界值為20.1%，將患者分為AT Ⅲ≥20.1%組(151例)和AT Ⅲ<20.1%組(118例)，Kaplan-Meier生存分析顯示，AT Ⅲ≥20.1%組的ACLF患者28 d平均生存時間為22 d，AT Ⅲ<20.1%組患者的平均生存時間為17 d，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-Rankχ2=10.894,P=0.001)。見圖3。進(jìn)一步對ACLF患者治療5 d后AT Ⅲ活性與28 d死亡率分析結(jié)果顯示，治療5 d后28 d死亡組患者AT Ⅲ活性較存活組明顯降低[17.8%(12.6%，25.2%) vs 22.6%(18.1%，30.9%),P=0.020]。

3 討論

ACLF是一類在慢性肝臟疾病基礎(chǔ)上并發(fā)急性肝臟損傷或多器官衰竭的疾病，短期死亡率高，預(yù)后較差，是臨床治療面臨的難題[8]。對ACLF患者早期、準(zhǔn)確的診斷是確?；颊攉@得更積極治療的前提，進(jìn)而可以降低患者短期死亡率并提高患者生存質(zhì)量。由于多數(shù)凝血酶及凝血因子在肝臟合成，肝臟是維持機體出凝血平衡的重要器官，因此，關(guān)注凝血系統(tǒng)中各項凝血因子的變化在早期診斷ACLF以及評價患者預(yù)后的作用顯得尤為重要。

本研究結(jié)果提示，隨著肝臟疾病的逐漸進(jìn)展，AT Ⅲ的活性逐漸降低，由于肝細(xì)胞是合成AT Ⅲ的主要場所，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時，AT Ⅲ的活性進(jìn)一步降低，同時體內(nèi)的炎癥環(huán)境促進(jìn)胰蛋白酶對AT Ⅲ活性的抑制作用，使AT Ⅲ的半衰期降低至約20 h[3,9]，導(dǎo)致機體AT Ⅲ活性嚴(yán)重不足。本文結(jié)果顯示，檢測患者外周血AT Ⅲ活性用于鑒別AD與ACLF具有較高價值(AUCROC=0.906)。該結(jié)果與Zhou等[4]研究結(jié)果一致，提示AT Ⅲ活性水平是具有評估肝臟疾病進(jìn)展價值的潛在實驗室指標(biāo)之一。本研究還顯示，入院時未發(fā)生ACLF但AT Ⅲ基線水平較低的AD患者，入院后發(fā)展為ACLF的風(fēng)險更高。AT Ⅲ是反映凝血功能是否紊亂的重要指標(biāo)，AT Ⅲ活性隨著疾病的進(jìn)展而降低，器官損傷的加重可促進(jìn)凝血系統(tǒng)-抗凝系統(tǒng)的消耗，進(jìn)一步激活纖溶系統(tǒng)，極易伴發(fā)DIC[3]。因此，我們初步認(rèn)為，對于AT Ⅲ活性低但尚未診斷為ACLF的患者，在密切關(guān)注病情進(jìn)展的同時應(yīng)動態(tài)監(jiān)測AT Ⅲ水平，該指標(biāo)的變化可協(xié)助臨床醫(yī)生判斷是否需要及時糾正AT Ⅲ水平以利維持凝血功能平衡。

本研究數(shù)據(jù)顯示，在ACLF患者中，AT Ⅲ活性水平與評估患者不良預(yù)后的評分系統(tǒng)均呈負(fù)相關(guān)，在合并凝血功能衰竭或腎臟功能衰竭患者中AT Ⅲ活性水平顯著降低。本研究通過生存曲線分析結(jié)果提示，患者入院AT Ⅲ活性的基線水平與患者短期生存率相關(guān)，當(dāng)患者AT Ⅲ≥20.1%時，28 d生存率顯著高于AT Ⅲ<20.1%的患者。動態(tài)觀察患者治療5 d后AT Ⅲ活性水平變化發(fā)現(xiàn)，AT Ⅲ活性低的ACLF患者仍然具有短期死亡的高風(fēng)險，提示AT Ⅲ活性可用于評估HBV感染相關(guān)ACLF患者短期(28 d)死亡風(fēng)險，AT Ⅲ活性越低ACLF患者28 d生存率越低。AT Ⅲ活性也與機體多器官功能狀態(tài)密切相關(guān)。既往的研究表明，AT Ⅲ是評價肝臟合成功能的重要指標(biāo)之一，不僅可以作為肝癌術(shù)后肝臟是否發(fā)生失功能的重要指標(biāo)，也是預(yù)測肝硬化患者是否發(fā)生肝性腦病的實驗室指標(biāo)之一[9]。另外研究顯示AT Ⅲ的抗炎作用還表現(xiàn)出一定的腎臟保護作用，在缺血再灌注損傷模型中，AT Ⅲ基因敲除小鼠呈現(xiàn)出更嚴(yán)重的腎臟功能受損，外源給予AT Ⅲ能減輕腎臟的缺血再灌注損傷并減少促炎型巨噬細(xì)胞的滲出，起到減輕腎臟損傷的保護性作用[10-11]。在心臟外科手術(shù)中，低AT Ⅲ患者進(jìn)展為急性腎損傷的風(fēng)險增高[12-13]。本研究結(jié)果提示ACLF合并腎臟衰竭的患者AT Ⅲ活性更低，推測肝臟損傷所致AT Ⅲ降低和腎損傷所致的AT Ⅲ丟失也可能進(jìn)一步共同促進(jìn)和加重了ACLF患者腎功能衰竭。

目前ACLF患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)還未統(tǒng)一，不同標(biāo)準(zhǔn)關(guān)注焦點不一樣，亞洲肝病協(xié)會的定義主要關(guān)注肝臟功能和凝血功能是否紊亂，而歐洲肝臟研究學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)主要關(guān)注腎臟功能是否發(fā)生減退及患者器官衰竭的個數(shù)。對于ACLF患者預(yù)后評估目前常用MELD(終末期肝病模型)、CLIF-C OF(慢性肝衰竭器官衰竭評分)和CLIF-C ACLF(慢性肝臟衰竭-慢加急性肝衰竭評分)等模型評分系統(tǒng)進(jìn)行短期生存率評估，由于評分系統(tǒng)涉及多個指標(biāo)，在提高預(yù)后評估靈敏度的同時也增加了臨床應(yīng)用復(fù)雜程度和時間。AT Ⅲ不僅作為參與凝血功能穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)蛋白，也有研究表明AT Ⅲ表達(dá)水平與肝臟合成功能、腎臟功能及炎癥反應(yīng)相關(guān)[10,14-16]。我們認(rèn)為AT Ⅲ在涉及多器官損傷的ACLF患者中發(fā)揮重要作用?？紤]研究中樣本量有限，本研究著重對AT Ⅲ因素在ACLF患者預(yù)后及AD患者疾病進(jìn)展的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行評估，暫未對多因素模型進(jìn)行分析和討論。

本研究結(jié)果的重要性旨在提示基線水平AT Ⅲ的活性不僅可以作為臨床醫(yī)生鑒別診斷ACLF和AD的重要指標(biāo)，同時可以作為評估ACLF患者短期死亡風(fēng)險的重要指標(biāo)之一，密切監(jiān)測ACLF患者血漿AT Ⅲ活性有助于對疾病進(jìn)展的準(zhǔn)確評估，也有助于協(xié)助指導(dǎo)ACLF患者的臨床治療，但是由于本研究屬于小樣本的回顧性分析，且尚缺乏更多的文獻(xiàn)或理論支撐，因此還需要通過大樣本的隊列研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗證。