多發(fā)性骨髓瘤患者ABO血型鑒定異常的原因分析及處理方法

成婧，蔣敏，林春艷，孫靈迪，張靖南，王雪明(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，江蘇蘇州215000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者多伴有貧血，需輸血治療，但是患者外周血成分變化常常會(huì)引起ABO血型鑒定困難[1]。本研究對(duì)我院近3年177例MM患者中81例血型鑒定異常的原因進(jìn)行分析并進(jìn)行相應(yīng)的處理，保證血型鑒定的準(zhǔn)確性，從而保障臨床安全用血。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2016年5月至2019年6月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的177例MM患者，均符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》中MM的診斷標(biāo)準(zhǔn),其中男109人，女68人；年齡34～88歲，中位年齡為60.0歲。

1.2標(biāo)本采集與處理 所有研究對(duì)象均抽取EDTA-K2抗凝血2 mL，3 000 r/min(離心半徑20 cm)離心5 min。

1.3儀器與試劑 Immucor Galileo NEO全自動(dòng)血型儀(美國(guó)IMMUCOR公司)，恒溫水浴箱(蘇州鉑西瓦公司)，臺(tái)式離心機(jī)(北京白洋公司)，血型血清學(xué)離心機(jī)(瑞士DiaMed GmbH公司)，PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；抗A、抗B、抗AB與抗H試劑(上海生物醫(yī)藥試劑公司)， ABO標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞(美國(guó)IMMUCOR公司)，ABO血型鑒定卡(長(zhǎng)春博迅公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(CAT：DP318-02，北京天根公司)，Prime STAR Max DNA Polymerase (CAT：R045，日本TaKaRa公司)。

1.4方法

1.4.1ABO及Rh血型鑒定 采用Immucor Galileo NEO全自動(dòng)血型分析儀進(jìn)行ABO及Rh血型檢測(cè)，對(duì)血型正反定型不符的標(biāo)本再采用傳統(tǒng)的試管法復(fù)檢。

1.4.2吸收放散試驗(yàn) 對(duì)全自動(dòng)血型分析儀和傳統(tǒng)試管法檢測(cè)后仍然無(wú)法確定血型的標(biāo)本，采用吸收放散試驗(yàn)。在1 mL壓積紅細(xì)胞中加入等體積相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗A/抗B單克隆抗體試劑，置4 ℃冰箱吸收2 h后用冰生理鹽水洗滌6遍(檢測(cè)最后1次洗滌的上清液，確保洗滌干凈，無(wú)加入抗體殘留)，再加入等體積生理鹽水，置56 ℃水浴箱內(nèi)不停振搖10 min，立即3 000 r/min離心，吸取上清液100 μL，加入50 μL相應(yīng)的試劑紅細(xì)胞離心后觀察結(jié)果。

1.4.3唾液血型物質(zhì)測(cè)定 輔助鑒定ABO血型，將唾液煮沸10 min，試管中分別加入已標(biāo)化的抗A、抗B、抗H試劑(以出現(xiàn)3+凝集的最高稀釋度作為最適稀釋度)，再加入等體積唾液(對(duì)照管用生理鹽水代替唾液)室溫中和5 min后，再分別加入對(duì)應(yīng)的試劑紅細(xì)胞，混勻，1 000 r/min離心觀察結(jié)果，具體操作詳見(jiàn)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)。

1.4.4生理鹽水重懸 對(duì)于2例白球比倒置引起的反定型均凝集的標(biāo)本，離心去除上清液后加入100 μL生理鹽水重懸后離心，觀察結(jié)果。

1.4.5分子生物學(xué)基因分型 對(duì)3例需要通過(guò)分子生物學(xué)進(jìn)一步確定ABO血型的標(biāo)本，用血液DNA提取試劑盒抽提患者外周血DNA，對(duì)其第6和第7外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參考文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)引物序列：Exon6-F：5′-TGGAAGGGTGGTCAGAGG-3′，Exon6-R：5′-CTGGAGAAGGAGCTGGGTT-3′，Exon7-F：5′-TGGGAAGAGGATGAAGTGAAT-3′，Exon7-R；5′-CAACAGGACGGACAAAGGA-3′ ，引物由蘇州虹訊生物科技公司合成。PCR體系共20 μL，包含基因組DNA模板2 μL(DNA濃度60～140 ng/μL)，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，Primier STAR Max 10 μL，滅菌蒸餾水6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物取5 μL用于15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)有條帶后取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(未純化)送蘇州虹訊生物科技公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序儀為ABI 3730系列高通量基因分析儀，用DNAssist 2.2軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中A101標(biāo)準(zhǔn)序列(NG-006669)進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1血型鑒定結(jié)果 177例MM患者中，有81名血型鑒定異常。經(jīng)過(guò)各種對(duì)應(yīng)的方法處理后，確保血型鑒定無(wú)誤。原因分析、處理方法具體見(jiàn)表1。

表1 81例血型鑒定異常MM患者的原因分析及處理方法

2.281例MM患者血型鑒定異常的具體血型血清學(xué)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 81例MM患者的血型血清學(xué)結(jié)果

2.3測(cè)序結(jié)果 對(duì)2例抗A、抗B抗體均缺失和1例A抗原減弱患者ABO基因第6、7外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，用DNAssist 2.2軟件將測(cè)序結(jié)果與A101標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示2例抗A、抗B抗體均缺失的患者ABO基因第6外顯子均存在261delG(圖1)，基因型為O01/O01；1例A抗原減弱的患者ABO基因第7外顯子存在467C>T(圖2)，基因型為A102/A102。

3 討論

MM是惡性漿細(xì)胞病中多發(fā)的一種類型，特征是正常的漿細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒怨撬枇黾?xì)胞，并產(chǎn)生大量異常的免疫球蛋白，稱為M蛋白或者副蛋白[3]。

MM患者M(jìn)蛋白的大量分泌影響了正常免疫球蛋白和特異性抗體的分泌，導(dǎo)致ABO血型反定型抗A、抗B抗體(主要是IgM類抗體)減弱甚至缺失[4]。本研究中81例ABO血型鑒定異常中有72例抗體減弱，6例抗體缺失。處理方法：在反定型試管中血漿加量至2～3倍，室溫靜置10 min讓抗原抗體充分反應(yīng)后再多次離心觀察結(jié)果。這種方法增加了抗原抗體反應(yīng)的凝集強(qiáng)度，提高了ABO血型鑒定的正反定型符合率，另外抗體丟失案例再配合吸收放散試驗(yàn)和唾液試驗(yàn)來(lái)確證血型。遇到2例抗A、抗B均缺失的患者采用分子生物學(xué)方法鑒定血型，結(jié)果顯示血型皆為O01/O01。

此外，M蛋白的大量分泌可導(dǎo)致患者血漿中球蛋白含量增高，白球比倒置，球蛋白異常增多并包裹紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷減少，紅細(xì)胞之間的排斥力減弱從而引起異常的緡錢狀凝集[5]。本次實(shí)驗(yàn)中81例ABO血型鑒定異常者中有2例為蛋白質(zhì)凝集干擾。處理方法：試管法離心后，反定型管棄去上清液，加入100 μL生理鹽水重懸后再次離心觀察，緡錢狀凝集即可消散，而抗原抗體的真凝集則不會(huì)消散[6]。

MM患者引起ABO血型抗原減弱的機(jī)制尚不明確，可能與以下因素存在一定的相關(guān)性：血漿中異常M蛋白的大量增多使合成A、B抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏或受到抑制，導(dǎo)致H抗原轉(zhuǎn)變?yōu)锳或B抗原被阻斷[7]；MM患者的骨髓造血功能異常，分泌大量漿細(xì)胞，使紅細(xì)胞系統(tǒng)受到抑制，成熟紅細(xì)胞減少或形態(tài)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致紅細(xì)胞表面血型抗原減弱[8]；ABO基因和癌基因c-abl都位于第9號(hào)染色體上q34位點(diǎn)，有可能癌基因干擾了ABO基因，從而引起ABO抗原減弱[9]。本次實(shí)驗(yàn)中81例ABO血型鑒定異常者中有1例抗原減弱。處理方法：在排除ABO亞型的前提下，增加了吸收放散試驗(yàn)、唾液試驗(yàn)和基因檢測(cè)，分子生物學(xué)檢測(cè)后結(jié)果顯示患者ABO血型基因型為基因型為A102/A102，證實(shí)為抗原減弱。

綜上所述，MM患者由于抗體減弱或缺失、抗原減弱、白球比倒置等因素可引起ABO血型鑒定異常，日常工作中需要結(jié)合病史，綜合生化結(jié)果、臨床用藥情況等各方面原因，正確選擇試管法、吸收放散試驗(yàn)、唾液血型物質(zhì)檢測(cè)等血清學(xué)方法，必要時(shí)采用分子生物學(xué)基因分型以確保血型鑒定的正確性，從而保障臨床安全用血[10]。