4例COVID-19患者不同類型標本的SARS-CoV-2核酸及抗體檢測結果分析

盧婷，陳雨欣，沈瀚(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 210009)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)具有高傳染性、高隱匿性和高致病性的特點[1]，引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難，重癥患者多發(fā)展成呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、多功能器官衰竭等[2]，早發(fā)現(xiàn)、早治療是控制疫情的關鍵。臨床上主要采用商品化的試劑盒進行核酸檢測和血清學抗體檢測。實時熒光RT-PCR檢測是診斷SARS-CoV-2的確診方式[2]，但是目前核酸檢測假陰性率較高，與部分患者臨床癥狀不符，給臨床診治帶來困擾。本研究通過留取確診患者多種樣本(包括鼻咽拭子、糞便、尿液、血液)進行病毒核酸檢測及病毒血清抗體檢測，旨在提高患者病毒檢出率，盡快確診。

1 資料和方法

1.1研究對象 患者1，男，35歲，主訴“咽部不適”，2020年2月3日出現(xiàn)頭疼、惡心欲吐，2月4日入本院發(fā)熱門診就診，當日檢測咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，2月5日復檢咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，結合影像學、臨床癥狀和核酸檢測結果確診為COVID-19，2月5日轉入定點醫(yī)院治療。

患者2，男，56歲，主訴“咳嗽、發(fā)熱1 d”，2020年1月30日曾與武漢返寧人員有接觸史，2月1日出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱癥狀，2月2日入本院發(fā)熱門診治療，溫度38.2 ℃，當日檢測咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，2月3日復檢咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，結合臨床表現(xiàn)、接觸史及核酸檢測結果確診為COVID-19，2月3日轉入定點醫(yī)院治療。

患者3，男，27歲，主訴“發(fā)熱2 d”，2020年1月28日與武漢返寧人員有接觸史，1月29日出現(xiàn)發(fā)熱，2月1日入發(fā)熱門診就診，溫度38.0 ℃，當日檢測咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，2月2日咽拭子SARS-CoV-2核酸復檢陽性，結合臨床表現(xiàn)、接觸史及核酸檢測結果確診為COVID-19，2月2日轉入定點醫(yī)院治療。

患者4，女，62歲，主訴“發(fā)熱5 d”，2020年2月2日入發(fā)熱門診就診，溫度38.5 ℃，當日咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測陽性，2月3日咽拭子SARS-CoV-2核酸復檢陽性，結合臨床表現(xiàn)、影像學及核酸檢測結果確診為COVID-19， 2月3日轉入定點治療醫(yī)院治療。

1.2標本采集 采集咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測陽性的4名COVID-19患者的不同類型標本，包括鼻拭子、糞便、尿液、血液，所有標本在咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測陽性后的24 h內(nèi)采集完畢。咽拭子、鼻拭子、尿液保存在病毒采樣管(包含生理鹽水和RNA酶抑制劑)內(nèi)；糞便標本取花生米大小量放入病毒采樣管，渦旋震蕩2次，每次15 s，2 000 r/min離心5 min；空腹狀態(tài)下抽取患者5 mL血液保存在有分離膠的采血管內(nèi)，3 000 r/min離心5 min，分離血清后備用。

1.3儀器與試劑 Cobas LightCycler480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，新型冠狀病毒(2019)核酸檢測試劑盒和配套核酸提取液(碩世公司)，i Flash 3000-H化學發(fā)光免疫分析儀以及配套新型冠狀病毒免疫球蛋白IgM和IgG抗體化學發(fā)光法檢測試劑盒(深圳亞輝龍公司)。

1.4核酸提取和擴增 上述標本采用核酸提取和檢測試劑盒進行RNA提取和擴增，按試劑盒說明書進行操作。將反應管放入Cobas LightCycler480實時熒光定量PCR儀擴增，擴增參數(shù)：50 ℃逆轉錄30 min；95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃ 40 s退火、延伸及檢測熒光，45個循環(huán)。結果判斷：FAM、VIC通道分別對應SARS-CoV-2的ORFlab基因和N基因；陽性：2個通道同時滿足待測樣本循環(huán)閾值(Ct)≤35，擴增曲線呈S型；陰性：2個通道結果Ct>38或未檢出；可疑：有一個通道結果Ct≤35，其他一個通道35

1.5化學發(fā)光法檢測病毒IgM/IgG 定點醫(yī)院將4名患者血清送本院檢測SARS-CoV-2抗體。用i Flash 3000-H化學發(fā)光免疫分析儀及配套新型冠狀病毒IgM和IgG抗體檢測試劑盒檢測。結果<10 AU/mL為陰性，≥10 AU/mL為陽性。

2 結果

2.1不同類型標本SARS-CoV-2核酸檢測結果 4名患者中咽拭子全部為陽性，2名鼻拭子陽性，3名糞便標本陽性，尿液標本均未檢出病毒，1名血清標本可疑，見表1。

表1 患者不同部位采集標本的核酸Ct值

2.2血清SARS-CoV-2抗體檢測結果 患者3在2月4日檢測結果為IgM 14.36 AU/mL，IgG 82.29 AU/mL，2月7日檢測結果為IgM 61.96 AU/mL，IgG 152.67 AU/mL。其余患者一周內(nèi)IgM和IgG檢測均為陰性。

3 討論

本文通過4名COVID-19確診患者的咽拭子、鼻拭子、糞便、尿液、分離血清中的核酸以及血清抗體檢測發(fā)現(xiàn)：患者的咽拭子檢出率最高，其次是糞便、鼻拭子，1名患者血清核酸結果可疑，尿液標本均未檢出病毒核酸。本研究中咽拭子檢出率最高，糞便標本中病毒同樣也有較高的陽性率，說明患者在感染早期腸道內(nèi)也易攜帶病毒[3]；其他樣本類型陽性率不高?？赡苡捎诨颊咛幱诓〕淘缙冢∏檩^輕，病毒潛伏期長且病毒載量低，核酸檢測試劑盒的靈敏度對于低載量病毒的檢出率低；不同部位存在的病毒載量有所不同，導致不同部位的標本病毒檢出率不同[4]。

在本研究中，患者1糞便標本中病毒載量高于鼻咽拭子，可能該患者的腸道病毒受體多于呼吸道受體，與個體差異有關?；颊?的鼻、咽拭子、糞便核酸檢測結果均為陽性，分離血清標本也可以檢出低載量的病毒，可能與患者男2的病情相對較重，病毒載量高有關，有文獻指出血液和肛拭子中病毒的檢出與重癥出現(xiàn)呈正相關，應注意監(jiān)測患者病情，警惕患者病情加重[5]。患者3在2月1日咽拭子核酸檢測陽性，尿液標本和糞便標本均陰性，2月4日化學發(fā)光法定量檢測患者血清IgM、IgG陽性，2月7日IgM、IgG進一步升高，說明患者血清中開始出現(xiàn)抗體，抗體的動態(tài)檢測可以確定患者是否感染及觀察治療效果，可運用于流行病學調(diào)查。由于以上患者確診后轉入定點傳染病醫(yī)院進行治療，我們無法獲得更多的血清學抗體動態(tài)數(shù)據(jù)。總之，SARS-CoV-2檢測時可以采取多種類型標本聯(lián)合檢測，提高病毒的檢出率，對于有臨床癥狀但核酸陰性的患者可以采用血清學抗體檢測作為補充，共同提高病毒檢測的陽性率，為病情的確診和疫情的控制提供支持。