新型冠狀病毒核酸和抗體聯(lián)合檢測的應用價值*

陳偉，吳成就，彭麗，梁劍琦，朱愛民，黃小曄(婁底市中心醫(yī)院檢驗科，湖南婁底 417000)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的傳染性極強的急性傳染病，早發(fā)現(xiàn)傳染源并進行隔離治療，是防治COVID-19的重要手段。新型冠狀病毒肺炎診療方案一直以來均推薦實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性作為疑似病例確診的診斷條件之一，但實時熒光RT-PCR技術對實驗場所及人員要求高、操作繁瑣、耗時長、檢測人員感染風險高、結(jié)果受標本質(zhì)量、病毒感染部位及表達量等因素影響較大[1]。血清特異性抗體檢測的操作簡單便捷，僅需采集血液標本，很大程度上降低醫(yī)護人員在標本采集和檢測過程中被感染的風險，是快速篩查和輔助診斷的重要手段[2]。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》已將血清學抗體檢測列入疑似病例確診的診斷條件之一[3]。鑒于2種檢測方法各自的特點，將核酸檢測和血清學檢測相結(jié)合可提高檢出率，不同類型患者可選擇不同的檢測方法。

1 資料和方法

1.1標本來源 收集2020年2月1日至2020年3月15日本院感染科隔離病房入院的26例確診COVID-19患者的咽拭子和血清標本。確診標準[3]：(1)有相應流行病學史；(2)有相關臨床表現(xiàn)(發(fā)熱和/或呼吸道癥狀、具有COVID-19影像學特征等)；(3)實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性。其中男性16例，女性10例，年齡(42.0±18.3)歲。分別于確診后第4、7、15、30和45天采集患者血液標本及咽拭子(對已出院患者進行回訪并在相應時間點采集血液和咽拭子標本)。

1.2儀器與試劑 Vii7-Dx熒光定量 PCR儀(ABI公司)；SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(湖南圣湘公司)，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測試劑盒(膠體金免疫層析法，康華公司)。

1.3SARS-CoV-2核酸檢測(實時熒光RT-PCR法) 待測標本56 ℃滅活30 min后，用SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒提取核酸，按照一步法試劑盒說明書配制反應體系：26 μL反應液，4 μL酶，20 μL核酸，共50 μL。反應參數(shù)：50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個循環(huán)。用Vii7-Dx熒光定量 PCR儀檢測，熒光通道選擇：VIC(內(nèi)標基因)、FAM(ORF1ab基因)、ROX(N基因)。結(jié)果判定：FAM或ROX通道檢測到典型的S型擴增曲線，且循環(huán)閾值(Ct)≤40為陽性；FAM、ROX通道未檢測到典型的S型擴增曲線，僅VIC通道有擴增曲線且Ct≤40為陰性。一步法檢測陽性標本采用伯杰新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR 法)作進一步確認。

1.4SARS-CoV-2血清抗體檢測(膠體金免疫層析法) 用捕獲法檢測血清樣本中的IgM抗體，雙抗原夾心法檢測IgG抗體，標本3 000 r/min 離心10 min后，離心機內(nèi)靜置15 min后取出，二級生物安全柜內(nèi)開蓋。取10 μL待檢血清至加樣處，隨即滴加80 μL樣本稀釋液至加樣處，均于15～30 min后觀察結(jié)果。根據(jù)試劑說明書直接進行肉眼判讀，當檢測區(qū)及質(zhì)控區(qū)各出現(xiàn)一條紅色反應線為陽性，僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色反應線為陰性。

2 結(jié)果

2.1核酸檢測轉(zhuǎn)陰后IgM/IgG抗體檢出率 26例確診患者病毒核酸檢測轉(zhuǎn)陰時間為(16.3±11.6)d,最短為6 d，最長為45 d(觀察截止時間)，轉(zhuǎn)陰當日IgM和IgG的檢出率分別65.38%(16/26)和53.85%(14/26)，2種抗體檢出率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.719，P>0.05)。

2.2不同時間點IgM/IgG抗體檢出率 根據(jù)IgM和IgG抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律，選擇5個時間點作為抗體檢測時間(第4、7、15、30、45天)，分析病毒感染后不同類型抗體產(chǎn)生后達到檢出限的時間和發(fā)展趨勢，IgM抗體在確診后15 d檢出率達到65.38%，而IgG抗體為46.15%。IgM抗體最早可在確診后4 d內(nèi)檢出(19.23%)，并在15 d左右達到峰值后檢出率逐漸下降，IgG抗體在確診后7 d左右可檢出(檢出率為7.69%)，并隨著時間延長檢出率持續(xù)上升并維持較長時間。見表1和圖1。

表1 26例COVID-19患者不同時間點血清抗體檢出率(%)

2.3不同時間點內(nèi)標基因、ORF1ab基因、N基因的Ct值 內(nèi)標基因在不同患者不同時間點的表達量基本恒定，ORF1ab基因和N基因表達量在一周內(nèi)出現(xiàn)明顯下降，N基因的下降速率明顯低于ORF1ab基因。到觀察截止時間點(45 d)仍有1例ORF1ab基因陽性(Ct為38.05)和5例N基因陽性(Ct為35.47±3.12)。見表2。

表2 不同檢測時間點SARS-CoV-2核酸檢測循環(huán)閾值(Ct)結(jié)果

3 討論

鑒于SARS-CoV-2的高傳染性，控制疫情蔓延最有力措施就是對確診患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療，國家推薦核酸檢測為新冠病毒肝炎確診的金標準，但同時核酸檢測也可因為采集部位、方法、病程等因素的影響而出現(xiàn)假陰性結(jié)果[4-5]。膠體金免疫層析法具有快速、操作簡便等特點，相比核酸檢測，具有成本較低、對操作人員技術要求不高、無需特殊儀器、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點，適合于大面積推廣。

IgM抗體是機體在急性期感染時較早出現(xiàn)的抗體，親和力較低，持續(xù)時間短。IgG抗體是再次免疫應答產(chǎn)生的抗體，親和力較強，持續(xù)時間長，提示既往感染或是病程中后期。目前，COVID-19患者的體液免疫應答機制尚未完全明確，但其抗體變化規(guī)律與一般病毒感染存在一定的相似性[6-7]，SARS-CoV-2特異性IgM多在發(fā)病后3～5 d出現(xiàn)陽性。來自武漢的研究顯示：COVID-19患者IgM和IgG抗體檢測的敏感性分別為70.24%和96.10%，抗體檢出率較高[8]。本研究根據(jù)病毒感染的特異性IgM抗體和IgG抗體的產(chǎn)生規(guī)律，選擇5個時間點作為檢測時間(第4、7、15、30、45天)，分析病毒感染后不同類型抗體產(chǎn)生后達到檢出限的時間和發(fā)展趨勢，IgM抗體在確診后15 d檢出率達到65.38%，而IgG抗體為46.15%，IgM抗體最早可在確診4 d內(nèi)檢出，并在15 d左右達到峰值后逐漸下降，IgG抗體在7 d左右可檢出，并隨著時間延長檢出率持續(xù)上升并維持較長時間。

SARS-CoV-2基因組含有約29 000個堿基，有 12 個蛋白質(zhì)編碼區(qū)/開放讀碼框(ORF)，其中ORF1ab基因為RNA依賴的RNA聚合酶基因(RdRp)所在區(qū)域，編碼RNA聚合酶，負責病毒核酸復制[9]；N基因編碼核衣殼蛋白，是一種多功能結(jié)構蛋白，具有增強病毒基因組轉(zhuǎn)錄、病毒組裝過程中與其他蛋白質(zhì)結(jié)合等特征。有研究表明確診病例和無癥狀感染者第3周這2個基因的Ct值高于第2周，提示病程的進展、相關診療手段的實施，病毒載量隨著時間的延長而下降[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)，病毒2個基因的表達量隨著病程的進展下降程度不一樣。ORF1ab基因表達量在一周內(nèi)明顯下降，而N基因的下降速率明顯減慢，觀察結(jié)束時N基因的檢出率高于ORF1ab基因，可能與2種基因編碼的蛋白質(zhì)功能不同有關，治療過程中與病毒復制有關的ORF1ab基因表達受到明顯的抑制，而對核衣殼蛋白編碼基因(N基因)影響較小。N基因的持續(xù)表達對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的免疫刺激，從而提高抗體的產(chǎn)生效率。

核酸檢測和血清抗體檢測各有優(yōu)劣：核酸檢測成本高、技術要求高且費時，標本采樣、病毒滅活、核酸提取等過程對核酸檢測結(jié)果影響較大，容易出現(xiàn)假陰性；而血清抗體檢測因檢測時間短、操作簡便、具有較高的敏感性和特異性。本研究發(fā)現(xiàn)在感染早期(7 d內(nèi))核酸檢測檢出率較高，IgM抗體開始產(chǎn)生并且檢出率持續(xù)升高，而病程中后期IgM和IgG抗體的檢出率明顯高于核酸檢測。因此，可以將2種方法有效結(jié)合起來，以核酸檢測為主并輔以抗體檢測，以判斷感染早期、既往感染和無癥狀感染者。