固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中7種大環(huán)內(nèi)酯類藥物含量

龔 蘭，欒楓婷，溫天銳，陳 明，鄧博文，張澤璟，魏瑞成，王 冉

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室,江蘇 南京 210014)

大環(huán)內(nèi)酯類藥物(MALs)是由鏈霉菌產(chǎn)生的弱堿性抗生素，對革蘭氏陽性菌和支原體具有良好的抗菌活性，臨床上廣泛用于治療畜禽動物敏感菌引起的呼吸道、消化道和泌尿生殖系統(tǒng)感染[1-3]。MALs在低劑量下具有良好的促生長作用，可縮短飼養(yǎng)周期、提高飼料回報率，其中泰樂菌素、替米考星、吉他霉素等已成為畜禽專用抗生素[2]。近年來，作為飼料添加劑的MALs成為我國乃至世界范圍內(nèi)需求量和銷售速度增長最快的抗生素之一[4]。但長期使用這類抗生素不僅在動物體內(nèi)造成殘留，還會隨糞便排出體外進而污染環(huán)境[5],導(dǎo)致微生物菌群的失調(diào)和革蘭氏陽性菌耐藥性的增加，對動物及人類健康產(chǎn)生危害[6-7]?？紤]到MALs抗藥性在動物之間以及動物和人類間的傳遞性，歐盟委員會規(guī)定所有成員國禁止使用泰樂菌素、螺旋霉素、桿菌肽等抗生素飼料添加劑，規(guī)定在豬的肝、腎，家禽的肌肉、皮、脂肪、肝及腎中均不得檢出泰樂菌素[8]。我國最新發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定替米考星在動物組織和奶中的最大殘留限量(MRL)為50～1 500 μg/kg，泰樂菌素在動物組織、奶和蛋中的MRL為50～300 μg/kg[9]。我國相繼出臺了《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016-2020年)》(國衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2016]43號，簡稱行動計劃)和藥物飼料添加劑推出計劃(中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第194號)等政策，規(guī)定自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料[10-11]。但一些獸藥飼料生產(chǎn)廠家和養(yǎng)殖戶為了提高經(jīng)濟效益，違禁在飼料中添加此類藥物。

目前，MALs的檢測方法主要包括微生物法、毛細管電泳法、紫外分光光度法、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[1,12-14]。其中，微生物法、毛細管電泳法、紫外分光光度法由于具有前處理復(fù)雜、靈敏度低、準確度低、檢測種類受限等缺點，鮮有報道[12]。飼料檢測的常用方法為電化學(xué)法[14]、LC法[6]、LC-MS/MS法[6]，近年來LC-MS/MS法因靈敏度高、檢出限低、具有確證性等特點被廣泛用于飼料中添加劑的測定[6]。目前采用LC-MS/MS法測定MALs的研究主要針對畜禽肉制品、水產(chǎn)品、牛奶、蜂蜜等動物源性食品，而以飼料為分析對象的相關(guān)研究較少[15-18]，其主要困難是源于飼料基質(zhì)的復(fù)雜性和多樣性，以及待測化合物的含量低[18]。我國目前尚未制定測定飼料中MALs的標準方法，因此亟待建立飼料中該類抗生素的測定方法。

本文采用固相萃取(SPE)凈化,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中替米考星、羅紅霉素、螺旋霉素、泰樂菌素、紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素7種MALs的殘留量。該方法準確、實用、雜質(zhì)干擾小、基質(zhì)效應(yīng)低，能夠檢測多種飼料(添加劑預(yù)混合飼料、精料補充飼料、配合飼料、濃縮飼料)中目標化合物的含量，提高了檢測范圍和靈敏度，可為我國飼料質(zhì)量安全檢測和監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB 6500高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國 SCIEX公司)，電子天平(感量0.1 mg，瑞士Mettller-Toledo公司)；高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)；旋渦混合器(德國IKA公司)；超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；N-EVAP-24位氮吹濃縮裝置(美國Organomation公司)；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)、20位固相萃取裝置(美國Waters公司)，0.22 μm濾膜(美國Agilent公司)；賽多利斯超純水系統(tǒng)(德國Sartorius公司)。

標準物質(zhì)：替米考星(TILM)、羅紅霉素(ROM)、螺旋霉素(SPI)、泰樂菌素(TYL)、紅霉素(ERM)、克拉霉素(CLA)、阿奇霉素(AZI)(純度均≥95%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)。

甲醇、乙腈(色譜級，Honeywell公司)；甲酸(色譜級，Sigma-Aldrich公司)；去離子水(屈臣氏公司)；氨水、磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

樣品：添加劑預(yù)混合飼料、精料補充飼料、配合飼料、濃縮飼料(飼料企業(yè)饋贈)。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液(1.0 mg/mL)：分別準確稱取適量的標準品，用甲醇溶解并定容，配成1.0 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃下保存，有效期3個月。

混合標準中間液(10 μg/mL)：分別準確移取標準儲備液各1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用水-甲醇(體積比9∶1)稀釋至刻度，混勻。4 ℃下避光保存，有效期1周。

混合標準工作液：準確吸取混合標準中間液(10 μg/mL)適量，用水-甲醇(9∶1)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2、5、10、50 μg/L的系列混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準確稱取2.00 g飼料樣品(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL 1%氨化乙腈，超聲20 min，渦旋振蕩5 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液于另一50 mL離心管中；下層殘渣中加入10 mL 1%氨化乙腈，重復(fù)提取1次。合并2次上清液，量取1.0～2.0 mL上清液于另一10 mL離心管中，40 ℃氮吹至近干，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 9.0)溶解殘渣，待凈化。

Oasis PRiME HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 9.0)活化，上清樣液全部過柱后，用5 mL水淋洗、抽干，6 mL 5%氨化甲醇洗脫并收集洗脫液于10 mL離心管中，45 ℃下氮吹至近干，以1.0 mL水-甲醇(9∶1)復(fù)溶，渦旋30 s后過0.22 μm濾膜于樣品瓶中，上機測定。

1.4 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；進樣量為3 μL。洗脫梯度：0～1 min，10%B；1～2 min，10%～20%B；2～5 min，20%～50%B；5～6 min，50%～90%B；6～7 min，90%B；7.01～10 min，10%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，氣簾氣(CUR)為45 V，碰撞氣(CAD)為8 V，離子源電壓(IS)為5 500 V，離子源溫度(TEM)為500 ℃，霧化氣(GS1)壓力為344.8 kPa，輔助氣(GS2)壓力為379.2 kPa，掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，母離子、子離子、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表1。

表1 7種MALs的MRM質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters in multiple reaction monitoring(MRM) mode for 7 MALs

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類藥物呈弱堿性和脂溶性的特性[16]，本實驗選取甲醇、乙腈、1%氨化甲醇、3%氨化甲醇、1%氨化乙腈、3%氨化乙腈、1%甲酸甲醇、3%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈、3%甲酸乙腈作為提取溶劑，考察其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物回收率的影響。

結(jié)果表明，紅霉素、泰樂菌素和螺旋霉素在不同濃度的酸化溶液中回收率低于70%，這是由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物在酸性甲醇和乙腈溶液中呈電離狀態(tài)，且不穩(wěn)定所致[2]；根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的pKa值，弱堿性環(huán)境更有利于藥物提取，因此以1%氨化有機溶液作為提取溶劑時，提取效率提高至70%以上，且1%氨化甲醇和1%氨化乙腈的萃取效率高于3%的氨化有機溶液。進一步對比了1%氨化甲醇和1%氨化乙腈對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的提取回收率，發(fā)現(xiàn)1%氨化乙腈比1%氨化甲醇更利于沉淀飼料中的蛋白，7種藥物的回收率為80.0%～93.8%，且明顯減少其他雜質(zhì)的干擾[19]，所以選定1%氨化乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 凈化方法的選擇飼料的常用凈化方法有液液萃取法和固相萃取法，部分文獻采用正己烷液液萃取法進行凈化[13]，但只能去除部分脂類，對飼料中色素、其他脂類和小肽等雜質(zhì)的去除效果較差，本實驗采用正己烷直接凈化后質(zhì)譜基線抬高，儀器檢測靈敏度降低。因此，實驗比較了HLB(200 mg/6 mL)、MCX(150 mg/6 mL)和C18(200 mg/3 mL) 3種固相萃取凈化柱的回收率。結(jié)果顯示，采用HLB柱凈化后7種藥物的回收率為60%～120%，C18柱的回收率為30%～108%，而MCX柱的回收率均低于50%，故實驗選用HLB柱作為固相萃取凈化柱。

進一步優(yōu)化了HLB柱規(guī)格，考察了HLB(200 mg/6 mL)、Oasis PRiME HLB(200 mg/6 mL)和HLB(60 mg/3 mL)的回收率，結(jié)果表明TILM和SPI經(jīng)HLB(60 mg/3 mL)凈化后的回收率低于70%，可能是由于該柱的填料量較少，易造成其他雜質(zhì)和目標物產(chǎn)生競爭性相互作用，影響固相萃取柱的保留和洗脫；HLB(200 mg/6 mL)和Oasis PRiME HLB(200 mg/6 mL)對7種目標物的回收率均高于70%，其中后者的回收率相對較高，且可去除更多的脂類等雜質(zhì)，因此最終選擇Oasis PRiME HLB(200 mg/6 mL)作為凈化柱。

2.2.2 pH值的影響在上樣過程中，目標物的離子化程度影響其在SPE的吸附效率，實驗發(fā)現(xiàn)，pH≤4和pH≥10的情況均不利于藥物在固相萃取柱上的保留。比較了不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的0.1 mol/L磷酸緩沖液對7種目標物回收率的影響(見圖1)，結(jié)果顯示，pH 9.0時7種目標物的回收率最佳(大于80%)。這是由于弱堿性條件下大環(huán)內(nèi)酯類藥物以分子狀態(tài)存在，易保留在固相萃取柱上。因此實驗選擇磷酸緩沖溶液的pH值為9.0。

圖1 不同pH值對固相萃取效果的影響(加標10 μg/kg)Fig.1 Effect of pH value on SPE efficiencies(spiked 10 μg/kg)

2.2.3 洗脫條件的優(yōu)化HLB固相萃取柱的填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合而成的大孔共聚物，能夠保留多種極性差異較大的化合物[20]。實驗考察了1%甲酸甲醇、甲醇、3%氨化甲醇和5%氨化甲醇4種洗脫液的效果，結(jié)果表明1%甲酸甲醇和甲醇只能洗脫部分大環(huán)內(nèi)酯類藥物，7種藥物的回收率低于60%；5%氨化甲醇的洗脫能力最強，7種藥物的回收率均大于80%，因此實驗選擇5%氨化甲醇作為洗脫液。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+掃描模式下，分別對1 μg/mL 的7種藥物標準溶液進行母離子全掃描，確定母離子的去簇電壓，對其子離子進行掃描，選擇豐度較高、干擾較小的兩個子離子為定性離子，豐度最高的離子作為定量離子，并優(yōu)化其碰撞能量。實驗發(fā)現(xiàn)TILM、ROM、TYL、ERM、CLA和AZI均能形成[M+H]+的母離子，SPI除了形成[M+H]+的母離子m/z843.6，還形成m/z422.6的母離子碎片，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)m/z843.6受雜質(zhì)干擾小且響應(yīng)高，因此選擇m/z843.6作為SPI的母離子。優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.4”所示。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

大環(huán)內(nèi)酯類藥物屬于極性化合物，實驗采用C18反相色譜柱進行分離?？疾炝朔謩e以乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨和甲醇-5 mmol/L乙酸銨作為流動相時大環(huán)內(nèi)酯類藥物的分離情況，結(jié)果表明:0.1%甲酸水作為水相比5 mmol/L乙酸銨溶液更能明顯改善目標物的峰形，有助于堿性物質(zhì)的分離，并使目標化合物的保留時間提前[21]。進一步以0.1%甲酸水作為水相，發(fā)現(xiàn)當甲醇為有機相時7個目標物的峰形較差，而乙腈能明顯提高SPI和TILM的響應(yīng)值，峰形較好，且無拖尾現(xiàn)象。采用梯度洗脫，可實現(xiàn)飼料中雜質(zhì)與目標分析物的良好分離，同時縮短分離分析時間[22]。因此，本實驗以0.1%甲酸水和乙腈為流動相進行梯度洗脫，保證良好的峰形和分離度(見圖2)，這與文獻研究結(jié)果一致[6，23]。

圖2 7種待測藥物標準品的MRM圖(10 μg/L)Fig.2 MRM chromatograms of 7 MALs mixed standard solution(10 μg/L)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

飼料由玉米、小麥、麩皮、棉粕、豆粕等混合而成，基質(zhì)復(fù)雜，樣品經(jīng)提取凈化后仍可能存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，因此需對前處理方法進行基質(zhì)效應(yīng)的評估[22]。

將“1.2”配制的10 μg/L混合標準工作液，添加至按照“1.3”制備的小豬配合飼料、豬濃縮飼料、雞預(yù)混合飼料、牛羊精補飼料和魚配合飼料的空白基質(zhì)中，配制成10 μg/L大環(huán)內(nèi)酯類藥物的空白基質(zhì)混合標準液。以空白基質(zhì)中標準物質(zhì)的峰面積(A)和相對應(yīng)濃度的溶劑標準物質(zhì)的峰面積(B)之比考察基質(zhì)效應(yīng)(ME%=A/B×100%)[12]。若比值在80%～120%范圍內(nèi)，則表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯[19]。結(jié)果表明在最佳前處理條件下，TYL在小豬配合飼料、豬濃縮飼料和魚配合飼料中表現(xiàn)出較弱的基質(zhì)效應(yīng)(ME為101%～114%)，但在雞預(yù)混合飼料和牛羊精補飼料中存在中等強度的基質(zhì)增強效應(yīng)(ME為131%～141%)；其余6種藥物在小豬配合飼料、豬濃縮飼料、雞預(yù)混合飼料、牛羊精補飼料和魚配合飼料中存在較弱的基質(zhì)抑制或增強效應(yīng)(ME為80%～133%)。說明本實驗采取的固相萃取柱凈化和減少凈化上樣量的方式可有效降低基質(zhì)干擾、提高靈敏度，這與其他檢測方法中全部樣液過柱凈化相比，既節(jié)省凈化時間，又可有效去除雜質(zhì)[6,24]。為了消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量偏差，采用基質(zhì)混合標準工作液進行定量[25]。

2.6 方法驗證

稱取2 g空白樣品，按照“1.3”處理后，加入“1.2”中不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液復(fù)溶，配成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標準工作液，采用外標法進行定量計算。以目標物的峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X，μg/L) 進行回歸分析，結(jié)果表明在小豬配合飼料、牛羊精補飼料、豬濃縮飼料、雞預(yù)混合飼料和魚配合飼料中，替米考星、螺旋霉素和紅霉素的線性范圍為0.5～50 μg/L，羅紅霉素、泰樂菌素、克拉霉素和阿奇霉素的線性范圍為0.25～50 μg/L，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。以空白樣品3倍信噪比(S/N)時的質(zhì)量濃度為檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)時的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)，得到7種物質(zhì)的LOD為1.25～2.5 μg/kg，LOQ為2.5～5.0 μg/kg。代表性基質(zhì)小豬配合飼料中7種目標物的線性關(guān)系、檢出限及定量下限見表2。本方法的檢出限(1.25～2.5 μg/kg)低于其他相關(guān)文獻[6,23-24]，靈敏度更高。

表2 小豬配合飼料中7種MALs的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations,LODs and LOQs of 7 MALs in piglet compound feed

2.7 回收率與相對標準偏差

在添加劑預(yù)混合飼料、精料補充飼料、配合飼料和濃縮飼料空白樣品中添加5、10、50 μg/kg 3個濃度水平的7種目標物混合標準溶液，重復(fù)進行3次實驗。結(jié)果表明,4種飼料基質(zhì)中7種藥物的回收率為61.4%～103%，批內(nèi)和批間的相對標準偏差(RSD)為0.43%～15%，其中配合飼料中7種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的加標回收率和RSD見表3。本方法的準確性和精密度均較為理想，能夠滿足飼料中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的定性和定量分析要求。

表3 配合飼料樣品中7種MALs的加標回收率和相對標準偏差(n=5)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of 7 MALs in complete feed(n=5)

2.8 實際樣品檢測

采用所建立的方法對市售不同類型的20份飼料(中期肉雞配合飼料、肉雞預(yù)混合飼料、魚配合飼料、肉羊肉牛專用精補飼料、豬濃縮飼料、豬預(yù)混合飼料)進行檢測，在1份中期肉雞配合飼料中檢出泰樂菌素，含量為1.69 mg/kg，其他飼料均未檢出目標物。

3 結(jié) 論

大環(huán)內(nèi)酯類藥物為堿性化合物，在酸性條件下部分藥物不穩(wěn)定，本實驗采用1%氨化乙腈為提取溶劑，Oasis PRiME HLB柱進行凈化，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測不同種類飼料中7種大環(huán)內(nèi)酯類藥物。該方法的檢出限為1.25～2.5 μg/kg，定量下限為2.5～5.0 μg/kg，回收率為61.4%～103%，批內(nèi)和批間RSD為0.43%～15%。方法簡便、靈敏度高、基質(zhì)干擾小，能滿足不同飼料樣品的測定要求，可為飼料質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。