狗棗獼猴桃多酚對60Coγ射線輻射損傷小鼠免疫系統(tǒng)保護(hù)作用的研究

左麗麗 ， 李昰奇 ， 富校軼 ， 高永欣 ， 王振宇 ， 王舒然

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 ， 吉林 吉林 132013 ; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150090)

隨著科技的不斷進(jìn)步，輻射已經(jīng)滲透到生活的各個(gè)領(lǐng)域，輻射造成的損傷日益嚴(yán)重[1-4]。輻射會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧自由基，自由基攻擊DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，從而產(chǎn)生一系列的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終誘發(fā)機(jī)體的衰老、免疫力低下、炎癥、癌癥等一系列疾病。輻射防護(hù)劑普遍存在毒副作用，能夠誘導(dǎo)機(jī)體正常的器官和組織損傷，不宜長期服用。因此尋找高效、無毒或低毒、適宜人類長期服用的輻射防護(hù)劑是目前亟待解決的關(guān)鍵問題[5-8]。狗棗獼猴桃是東北地區(qū)的野生漿果，含有大量的活性成分。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，多酚是狗棗獼猴桃果實(shí)中重要的功效成分，具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等多種功能活性[9-11]。本文通過建立輻射誘導(dǎo)的氧化損傷模型，主要研究狗棗獼猴桃多酚在造血及免疫系統(tǒng)方面的輻射防護(hù)作用，旨在為其作為輻射防護(hù)劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 狗棗獼猴桃野生漿果采摘于黑龍江省大興安嶺地區(qū)；狗棗獼猴桃多酚(AKP，純度38.6%)由哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院制備；清潔級(jí)雄性昆明系小鼠6～8周齡，體重(22±2)g，許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-001，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；利可君片由江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ試劑盒，均購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 HR2006型料理機(jī)，購自飛利浦電子香港有限公司；TDZ4-WS型低速離心機(jī)，購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Sp-752PC型紫外可見分光光度計(jì)，購自北京光譜儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；KQ-5200超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；FD-18真空凍干機(jī)，購自上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；HT-2 酶標(biāo)儀，購自Biocell公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠輻射損傷模型的建立60Coγ射線誘導(dǎo)的小鼠氧化損傷模型見文獻(xiàn)[11]，輻射后第2天摘眼球取血，脫臼處死小鼠，迅速剝離小鼠的肝、脾等組織，放置在4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中清洗3次，去除血污及其結(jié)締組織，然后用濾紙將臟器表面的水分充分吸干，稱重并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 準(zhǔn)確吸取380 μL白細(xì)胞稀釋液加入20 μL血液，充分混勻后，吸取少量白細(xì)胞混懸液滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置2～3 min，待白細(xì)胞沉降后進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。在低倍鏡下觀察，白細(xì)胞近似成圓形，胞漿透亮，細(xì)胞核呈現(xiàn)紫黑色，并稍有折光。計(jì)數(shù)是計(jì)數(shù)池四角的4個(gè)大方格中所有的白細(xì)胞數(shù)。按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

I=A/4×N×107

(1)

I:白細(xì)胞數(shù)目(個(gè)/L)；A:4個(gè)大方格中所有的細(xì)胞數(shù)；N:稀釋倍數(shù)

1.2.3 碳廓清試驗(yàn) 小鼠輻射24 h后，將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋5倍后，按照0.1 mL/(10 g·bw)，從尾靜脈緩慢注入稀釋好的印度墨汁，待墨汁注射完畢，用秒表立即開始計(jì)時(shí)。注射墨汁結(jié)束后的2 min、10 min，使用預(yù)先用抗凝劑處理好的毛細(xì)管分別從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL，立即將其加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波長下測定吸光度值。隨后將小鼠脫臼處死，立即剖檢取其肝臟和脾臟，清洗血污，稱重并記錄數(shù)據(jù)。按照公式(2)、(3)分別計(jì)算吞噬指數(shù)及校正吞噬指數(shù)，以此來表示機(jī)體吞噬細(xì)胞的吞噬能力[12-13]。

吞噬指數(shù)k=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)

(2)

校正吞噬指數(shù)a=體重×k1/3/(肝重+脾重)

(3)

k：直線斜率，表示吞噬速率；a：反應(yīng)每單位組織重量的吞噬活性；A1:t1血標(biāo)本的吸光度值；A2:t2血標(biāo)本的吸光度值；t1:注入墨計(jì)后第1次采集血標(biāo)本的時(shí)間；t2:注入墨計(jì)后第2次采集血標(biāo)本的時(shí)間。

1.2.4 細(xì)胞因子白介素的測定 脾淋巴細(xì)胞懸浮液的制備[14]：在無菌條件下剖檢小鼠取出脾組織，將其放置到盛有適量的無菌Hank′s液培養(yǎng)皿中，使用鑷子將脾組織輕輕磨碎，制成單細(xì)胞懸浮液。然后使用200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，用Hank′s液充分洗滌細(xì)胞2次，每次以1 000 r/min的速度離心10 min。然后將細(xì)胞懸浮于1 mL的新鮮培養(yǎng)液中，用臺(tái)盼藍(lán)對其進(jìn)行染色并記錄活細(xì)胞數(shù)量(應(yīng)在95%以上)，最后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL左右。按照1 mL/孔的量加入到24孔培養(yǎng)板中，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每孔加入50 μL的Con A(終濃度為7.5 μg/mL)，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，離心收集上清液測定其中細(xì)胞因子含量[15-17]。細(xì)胞因子白介素IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的測定按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析 每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Original 8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 AKP對外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響 機(jī)體經(jīng)過γ射線照射后，會(huì)造成體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)不同程度降低，從而導(dǎo)致機(jī)體對抗外界細(xì)菌入侵的能力下降[18]。通過白細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，輻射后模型組與對照組相比白細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，如圖1所示，給藥陽性對照組白細(xì)胞得到一定程度的恢復(fù)，AKP給藥組使白細(xì)胞的數(shù)量都有顯著上升趨勢，隨著AKP濃度的升高，低、中劑量組白細(xì)胞數(shù)也逐漸升高，中劑量組的升高趨勢超過了陽性對照利可君片組，但高劑量組相比模型組也有升高，但不及中、低劑量組。因此，AKP具有很好的增加白細(xì)胞的能力，提高機(jī)體的免疫力。

圖1 AKP對輻射小鼠外周血白細(xì)胞的影響

2.2 AKP對白細(xì)胞中不同細(xì)胞形態(tài)變化的影響 顯微鏡下白細(xì)胞的形態(tài)變化，如中插彩版圖2所示，白細(xì)胞主要包括粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，空白對照組體內(nèi)細(xì)胞正常，細(xì)胞膜完整清晰可見，當(dāng)輻射后，細(xì)胞受到不同程度的傷害，分葉細(xì)胞內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)異型，顯示出輻射對機(jī)體造成了損傷。每個(gè)片子隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，并記錄不同形態(tài)的細(xì)胞數(shù)。如圖3所示，氧化傷害后模型組損傷的細(xì)胞數(shù)顯著增加，而AKP和利可君片加藥組能夠明顯降低白細(xì)胞的損傷程度，對粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的完整性都起到不同程度的防護(hù)作用。

圖3 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)分析各類細(xì)胞損傷情況

2.3 AKP對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 胸腺是生物體重要的中樞免疫器官，同時(shí)也是T細(xì)胞發(fā)育及分化的主要場所，它的功能是介導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[19-20]。γ-射線照射小鼠，根據(jù)其體重、脾臟和胸腺的質(zhì)量分別計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，結(jié)果如表1所示。與正常對照組相比，機(jī)體受到輻射后脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，這表明脾臟和胸腺受到嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致免疫器官細(xì)胞的損傷或凋亡。與模型組相比，給藥組利可君片使脾臟和胸腺指數(shù)極顯著提高(P<0.01)，AKP不同濃度的劑量組也不同程度的提高了小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，且中劑量組效果最佳，但是不及利可君片組。因此，AKP和利可君片均可提高輻射小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，減少輻射對機(jī)體造成的損傷，同時(shí)在一定程度上也促進(jìn)了免疫器官的恢復(fù)。

表1 狗棗獼猴桃多酚對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

2.4 AKP對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 非特異性免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力能夠有效反映動(dòng)物的非特異性免疫功能。小鼠尾靜脈注射印度墨汁，其碳粒迅速被肝臟、脾臟等器官內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞吞噬而使其血漿濃度下降，因此，其廓清速率間接反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能[19]。由表2可以看出，輻射后模型組吞噬指數(shù)明顯降低，與正常對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，表明該組中小鼠的免疫功能受到嚴(yán)重的抑制，利可君片組以及灌胃AKP的低劑量組吞噬指數(shù)顯著升高(P<0.05)，中劑量和高劑量組與模型組相比吞噬指數(shù)也有顯著提高，碳廓清指數(shù)與模型組比較有顯著的改善(P<0.05)，但低于正常對照組，且中、高劑量組之間差異不顯著，即AKP能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，加速對碳粒的清除。

表2 狗棗獼猴桃多酚對小鼠吞噬指數(shù)的影響

2.5 AKP對輻射誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞形態(tài)的影響 淋巴細(xì)胞是對輻射非常敏感的器官，一旦受損就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫力下降[15,20]。圖4顯示顯微鏡下觀察到空白對照組脾淋巴細(xì)胞為圓形或橢圓形，邊緣整齊，大小均一。輻射后脾淋巴細(xì)胞數(shù)量變少，細(xì)胞多呈不規(guī)則形，胞膜邊緣不整齊，染色質(zhì)粗糙，呈粗網(wǎng)狀或成堆排列，細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，機(jī)體的免疫力急劇下降。輻射前給予機(jī)體不同濃度的AKP能夠顯著的改善脾淋巴細(xì)胞的形態(tài)，低、中劑量組隨著濃度的升高脾淋巴細(xì)胞的數(shù)量也逐漸增多，細(xì)胞的形態(tài)也趨于正?；?，中劑量組優(yōu)于高劑量組。而利可君片組能夠使脾淋巴細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)基本恢復(fù)正?；?，引起脾淋巴細(xì)胞以及DNA、RNA含量的增加，這表明AKP和利可君片均能夠有效提高機(jī)體的免疫力。

圖4 脾淋巴細(xì)胞的形態(tài)(40×)

2.6 AKP對白介素IL-2生成能力的影響 IL-2主要激活CD4+T1細(xì)胞的產(chǎn)生，又稱作T細(xì)胞生長因子，能夠引起T細(xì)胞的增殖，使T細(xì)胞激活并進(jìn)入分裂狀態(tài)，而T細(xì)胞的活化又抑制機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答[15]。IL-2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 44x-0.012 48，R2=0.999 84，脾淋巴細(xì)胞中IL-2的含量如圖5所示，輻射后模型組小鼠的脾細(xì)胞中IL-2的含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)，輻射前灌胃不同劑量的AKP和利可君片能夠顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞中IL-2細(xì)胞因子的分泌，與模型對照組相比，存在顯著性的差異，并隨著給藥劑量的增加，機(jī)體IL-2的分泌量也不斷升高，尤其是對高劑量組脾細(xì)胞中IL-2的作用更顯著，存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖5 AKP對小鼠脾細(xì)胞中IL-2生成能力的影響

2.7 AKP對白介素IL-4生成能力的影響 IL-4被認(rèn)為是典型的由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，隨著IL-4的激活，Th2細(xì)胞隨后產(chǎn)生附加的IL-4[21]，對于T、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育以及調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫起關(guān)鍵作用[22-23]。IL-4的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.001 19-0.032 89x，R2=0.995 01，輻射損傷后小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-4的含量如圖6所示，輻射后機(jī)體脾淋巴細(xì)胞中IL-4的含量有少量的降低，灌胃不同劑量的AKP和利可君片可促進(jìn)機(jī)體脾淋巴細(xì)胞中IL-4的分泌，但提高不顯著，只有高劑量的AKP顯著提高了脾淋巴細(xì)胞中IL-4的含量，其他劑量組之間也沒有顯著性差異。這表明AKP對機(jī)體分泌IL-4因子的效果不顯著。

圖6 AKP對小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-4生成能力的影響

2.8 AKP對白介素IL-10生成能力的影響 IL-10是抗炎因子，是幾個(gè)免疫反應(yīng)重要的調(diào)節(jié)器。IL-10的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=8.831 17E-4x+0.083 52，R2=0.998 6，輻射后小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-10的含量如圖7所示，輻射后小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-10的含量極顯著降低(P<0.01)。灌胃AKP能夠有效的提高機(jī)體中IL-10的含量，從而增加機(jī)體的免疫水平。利可君片沒有提高脾淋巴細(xì)胞中IL-10的含量，而中、高劑量組的AKP能夠顯著的促進(jìn)IL-10的分泌，但是與正常對照組之間還存在一定的差異(P<0.05)。

圖7 AKP對氧化損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-10生成能力的影響

2.9 AKP對干擾素IFN-γ生成能力的影響 IFN-γ可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、上調(diào)Fc受體和白血細(xì)胞粘附因子等的表達(dá)。IFN-γ通過與其特異性的細(xì)胞表面受體高親和力的結(jié)合，而發(fā)揮生物學(xué)活性[24-25]。IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.003 3x+0.115 54，R2=0.994 46。輻射后小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ的含量，如圖8所示，輻射導(dǎo)致機(jī)體脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ的含量極顯著降低(P<0.01)，灌胃不同劑量的AKP和利可君片后機(jī)體內(nèi)IFN-γ的含量不同程度的提高，但是組間沒有顯著性差異，且相對于正常對照組也還有一定的差異，這表明AKP促進(jìn)了機(jī)體中IFN-γ的分泌，顯著提高機(jī)體的免疫能力。

圖8 AKP對氧化損傷脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ生成能力的影響

3 討論

已有研究表明，輻射后機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)、器官以及組織都有可能受到損傷，其中造血組織最為敏感，造血組織損傷是機(jī)體最早出現(xiàn)的基本損傷之一[26-27]。射線會(huì)對機(jī)體的造血系統(tǒng)產(chǎn)生影響，射線作用于骨髓造血干細(xì)胞，使得細(xì)胞增殖能力下降，造血功能受阻，最直接的表現(xiàn)為外周血象降低[28-29]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，輻射導(dǎo)致小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量急劇減少，白細(xì)胞損傷嚴(yán)重，AKP的低、中、高劑量組使得輻射小鼠血液白細(xì)胞有一定程度的恢復(fù)，且分葉帶空泡粒細(xì)胞和破碎細(xì)胞的數(shù)量減少，表明AKP對造血系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。

胸腺和脾臟是機(jī)體2個(gè)重要的免疫器官，因此,動(dòng)物試驗(yàn)中脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)廣泛被用來作為免疫功能指標(biāo)進(jìn)行檢測。張成強(qiáng)等研究顯示，輻射導(dǎo)致小鼠脾臟和胸腺指數(shù)顯著降低，而葡萄籽多酚和藍(lán)莓多酚能夠明顯改善輻射小鼠的胸腺指數(shù)，并對脾臟指數(shù)有一定程度的提高[30]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，AKP低、中、高劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均高于模型組，且中劑量組效果最好，提示AKP能夠保護(hù)胸腺和脾臟，也就是說，AKP對免疫系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。另外，對單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響研究也提示，AKP有提高輻射小鼠免疫功能的作用，從而進(jìn)一步保護(hù)輻射小鼠形成免疫抑制等現(xiàn)象。

細(xì)胞因子是一類由活化的免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞)和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能蛋白質(zhì)多肽分子或糖蛋白，是免疫系統(tǒng)重要的信息分子，在免疫調(diào)節(jié)中充當(dāng)重要的角色。程翠林的研究發(fā)現(xiàn),輻射后小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫因子(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)出現(xiàn)不同程度的下降[31]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果，攝入不同濃度的AKP均能提高由刀豆蛋白刺激的輻照小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，并可以顯著提高小鼠脾臟中IL-2的分泌，誘生IFN-γ，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的分化以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞成熟，增強(qiáng)小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫能力，同時(shí)促進(jìn)IL-10的分泌，下調(diào)免疫抑制，維持機(jī)體的健康，即AKP通過促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌，特定的激活細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，從而有效的提高機(jī)體的免疫力。初步證實(shí)了AKP對輻射誘導(dǎo)的免疫損傷具有一定的保護(hù)作用，為其進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。