氟苯尼考的應(yīng)用及其毒副作用

胡東方 ， 孟凡亮 ， 銀 梅 ， 葛亞明 ， 劉思當(dāng)

(1.河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 河南 新鄉(xiāng) 453003 ； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山東 泰安 271018)

氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)LO)又稱氟甲砜霉素，是氯霉素類的第3代廣譜抗菌藥物。該藥最初上市時(shí)主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細(xì)菌性疾病的防控；隨后，F(xiàn)LO迅速在多個(gè)國家被批準(zhǔn)應(yīng)用于魚類疾病、牛呼吸系統(tǒng)細(xì)菌性疾病等的防治；在有些國家也被準(zhǔn)許添加在畜禽日糧中，以達(dá)到提高飼料轉(zhuǎn)化率及促生長等作用[1-2]。作為新一代動物專用的廣譜抗菌藥，F(xiàn)LO具有抗菌譜廣、吸收好、體內(nèi)分布廣、安全高效等特點(diǎn)，我國在2000年就通過了FLO作為二類新獸藥的審批。近10多年來，F(xiàn)LO被越來越多的應(yīng)用到我國獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，生產(chǎn)企業(yè)和產(chǎn)量也在不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2017年底，我國共有FLO獸藥生產(chǎn)批準(zhǔn)文號6 600余個(gè)，生產(chǎn)企業(yè)幾千家，且目前全國FLO原料藥的銷售量已達(dá)1 000余噸，表明FLO在我國畜禽及水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病防控過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[3]。

1 抗菌機(jī)理

由于氯霉素會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如再生障礙性貧血，目前在全球范圍內(nèi)該藥在食品動物生產(chǎn)中已被禁止使用。以甲磺?；?CH3SO2-)取代芳香環(huán)上的對位硝基(-NO2)而合成的甲砜霉素，便有效消除了氯霉素致再生障礙性貧血的風(fēng)險(xiǎn)；而進(jìn)一步將甲砜霉素分子中C3的羥基(-OH)用氟原子(-F)取代生成FLO(圖1)后發(fā)現(xiàn)，該舉措可有效降低細(xì)菌乙酰轉(zhuǎn)移酶對此位置的乙?；饔?，從而降低了藥物被細(xì)菌酶降解的程度，增強(qiáng)了藥物對氯霉素及甲砜霉素耐藥菌株的抗菌活性[4]。

圖1 3種氯霉素類藥物的分子結(jié)構(gòu)

FLO屬于一種抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的藥物，可以顯著抑制革蘭陽性菌和陰性菌，與氯霉素及甲砜霉素的抗菌機(jī)制相近。FLO進(jìn)入細(xì)菌菌體后可以和細(xì)菌核糖體50S大亞基上的A位點(diǎn)緊密結(jié)合，從而影響肽鏈延長過程中肽酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，使肽鏈的延長終止，最終起到抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)生成和抗菌的目的[2]。并且由于FLO分子中的α-OH被取代，使得FLO對細(xì)菌耐藥酶的耐受性大幅提高，所以該藥對氯霉素和甲砜霉素耐藥的細(xì)菌也具有良好抗菌活性[4]。

2 臨床應(yīng)用

FLO起初被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細(xì)菌性疾病的防控，對殺魚巴斯德菌、遲鈍愛德華菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌等絕大多數(shù)革蘭陰性和陽性的魚、蝦、蟹、貝類致病菌呈高度抗菌活性[5]，且FLO對常見致病菌的體外最低抑菌濃度一般在0.3～1.6 μg/mL[6]。在畜禽疾病防控方面，F(xiàn)LO曾被廣泛應(yīng)用與豬、禽、牛、羊等動物的細(xì)菌性疾病防控。在豬病臨床，F(xiàn)LO已被大量使用于由巴氏桿菌引起的豬肺疫、豬萎縮性鼻炎及胸膜肺炎放線桿菌等引起的呼吸系統(tǒng)疾病。在家禽方面，主要應(yīng)用于大腸桿菌病及傳染性漿膜炎等敏感菌所致疾病[1]。另外，F(xiàn)LO注射液也被用于治療各種年齡牛的呼吸系統(tǒng)細(xì)菌性疾病及腐蹄病。總的來說，F(xiàn)LO與其他常用抗菌藥物相比，對常見畜禽及水產(chǎn)動物致病菌有著較強(qiáng)的抗菌活性；同時(shí)，F(xiàn)LO對耐氯霉素和甲砜霉素的大腸桿菌、沙門菌及克雷伯菌等亦有良好抗菌作用。

近來研究表明，F(xiàn)LO除了具有抗菌作用外，還能夠抑制多種炎癥因子的產(chǎn)生并抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。鄧旭明教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LO能夠通過抑制NF-κB通路而降低由細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞及小鼠血清中TNF和IL-6的水平，并顯著提高內(nèi)毒素血癥小鼠的成活率[7-8]。此外，按照100 mg/(kg·bw)的劑量口服FLO后，對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠具有明顯保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在給藥小鼠肺臟水腫的比例和程度均明顯下降，且肺組織中及支氣管灌洗液中炎性細(xì)胞浸潤程度明顯降低；FLO通過對Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生及炎性細(xì)胞浸潤程度的抑制，可顯著改善由卵白蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠的呼吸功能[9]。以上研究表明，F(xiàn)LO除可作為抗菌藥用于細(xì)菌性疾病的治療外，在敗血性休克及呼吸系統(tǒng)炎癥的防治方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 毒副作用

FLO與前兩代藥物相比，具有更高的藥物安全性和抗菌效率，自上市之初至今，一直被作為獸醫(yī)臨床及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的明星藥物，應(yīng)用范圍廣、應(yīng)用量大。但近年來關(guān)于FLO毒副作用的報(bào)道也越來越多，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

3.1 免疫毒性 截至目前，F(xiàn)LO的諸多毒副作用中以免疫毒性的報(bào)道最多。最早關(guān)于FLO免疫毒性的報(bào)道可追溯至1987年，報(bào)道指出，與相同劑量的氯霉素相比，F(xiàn)LO可以顯著抑制中性粒細(xì)胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用[2]。Khalifeh等(2009年)發(fā)現(xiàn)20 mg/(kg·bw)的FLO連用5 d可顯著抑制雞新城疫疫苗特異性抗體的生成，表明FLO抑制了肉雞的體液免疫反應(yīng)[10]。Chrzastek等(2011年)發(fā)現(xiàn)治療劑量的FLO并未造成2日齡肉仔雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)的顯著變化，但是對法氏囊皮質(zhì)和髓質(zhì)中Bu-1+細(xì)胞的分布卻產(chǎn)生了顯著影響，表現(xiàn)在皮質(zhì)中Bu-1+細(xì)胞比例升高和髓質(zhì)中比例下降，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，F(xiàn)LO處理組法氏囊Bu-1+細(xì)胞的數(shù)量下降了近9%，表明B細(xì)胞的成熟受到了FLO的抑制[11]。Guan等(2011年)在小鼠體內(nèi)分別研究了FLO對口蹄疫疫苗及卵白蛋白免疫效果的影響，結(jié)果表明，F(xiàn)LO可顯著抑制脾細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)降低脾臟中CD19+B細(xì)胞的數(shù)目，高劑量時(shí)對CD3+T細(xì)胞的數(shù)目也產(chǎn)生明顯影響；此外，F(xiàn)LO顯著抑制了口蹄疫病毒及卵白蛋白的特異性抗體如IgG、IgG1和IgG2b的產(chǎn)生，表明FLO對小鼠的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平都有抑制作用[12]。而Lunden等(2000年)在研究抗生素對虹鱒魚的免疫毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療劑量的FLO連續(xù)處理10 d后，可以顯著降低虹鱒魚頭腎淋巴細(xì)胞的增殖活性，且虹鱒魚T細(xì)胞比B細(xì)胞更易受到FLO的影響[13]。Lis等(2011年)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LO可顯著降低小鼠外周血中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)抑制由SRBC免疫小鼠的體液免疫應(yīng)答能力[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，保育豬在免疫豬瘟病毒疫苗后按照50 mg/(kg·bw)的劑量連用7 d FLO，可導(dǎo)致脾臟及胸腺發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)損傷，主要表現(xiàn)在脾臟白髓和胸腺皮質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)疏松、淋巴細(xì)胞數(shù)量下降，同時(shí)，豬瘟疫苗特異性抗體水平也受到了影響，但是在停藥后2周左右即可恢復(fù)正常，表明FLO可導(dǎo)致保育豬發(fā)生暫時(shí)性的免疫器官結(jié)構(gòu)損傷和體液免疫抑制[15]。我們也在小鼠上對3種氯霉素類藥物的免疫毒性進(jìn)行了比較病理學(xué)研究，結(jié)果表明，3種藥物均可導(dǎo)致胸腺及脾臟發(fā)生萎縮和結(jié)構(gòu)損傷，其中以FLO導(dǎo)致的損傷作用最為嚴(yán)重；此外，藥物處理后脾細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞周期阻滯和增殖活性下降，細(xì)胞凋亡比例也明顯升高[16]?？偟膩碚f，F(xiàn)LO可造成免疫器官損傷，對不同動物均呈現(xiàn)出不同程度的體液免疫和細(xì)胞免疫抑制作用，其中以體液免疫抑制為主，但具體機(jī)制尚不明確。

3.2 胚胎發(fā)育毒性 除免疫毒性外，F(xiàn)LO導(dǎo)致的另一嚴(yán)重毒副作用即胚胎發(fā)育毒性。報(bào)道指出，按照10 mg/(kg·bw)飲水給予蛋雞FLO 5 d后發(fā)現(xiàn)，蛋雞所產(chǎn)受精蛋的孵化率降低了80%，而且FLO對孵化率的影響一直持續(xù)到停藥后1周左右[17]。Al-Shahrani等(2015年)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用90 mg/(kg·bw)的FLO連續(xù)飼喂公雞或母雞5 d后，給藥雞并未出現(xiàn)中毒癥狀；單獨(dú)對公雞飼喂FLO也不影響種蛋的孵化率，但是單獨(dú)對母雞飼喂后則可明顯降低種蛋的孵化率，與未給藥組相比降幅高達(dá)70%；在此過程中，雞胚主要在發(fā)育早期發(fā)生死亡，并以入孵5 d內(nèi)死亡為主；當(dāng)停藥4 d后，母雞所產(chǎn)受精蛋的孵化率即恢復(fù)正常。結(jié)果表明，F(xiàn)LO對入孵早期的雞胚具有胚胎發(fā)育毒性，而對采食FLO的公雞或母雞并無明顯毒性效應(yīng)[1]。此外，據(jù)Schering-Plough公司數(shù)據(jù)顯示，給大鼠按照12 mg/(kg·bw·d)的劑量連續(xù)飼喂90 d FLO后發(fā)現(xiàn)，大鼠的附睪重量顯著減輕，同時(shí)母鼠的泌乳性能受到影響，子代大鼠的成活率也明顯降低；對妊娠6～15 d的孕小鼠灌胃給予400 mg/(kg·bw)的FLO可亦導(dǎo)致胚胎死亡[1]。而截至目前，F(xiàn)LO所致胚胎發(fā)育毒性的機(jī)制尚不明確。

3.3 其他毒副作用 FLO在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中也被作為最常用的抗菌藥物之一，因此，眾多學(xué)者也就FLO對水生動物的安全性進(jìn)行了研究。Gaikowski等(2013年)研究發(fā)現(xiàn)，正常劑量或5倍劑量的FLO對羅非魚并無致死性，但會導(dǎo)致飼料消耗降低及體重減輕，且會導(dǎo)致魚鰓發(fā)生結(jié)構(gòu)損傷和功能異常，肝內(nèi)糖原型和脂類型肝細(xì)胞空泡增多，淋巴細(xì)胞減少及前腎細(xì)胞壞死增加等病變，表明FLO對羅非魚具有非致死性的毒副作用[5]。Botelho等(2015年)以幼齡羅非魚為對象研究了FLO的基因毒性，其結(jié)果表明，F(xiàn)LO可導(dǎo)致羅非魚紅細(xì)胞發(fā)生核異常，彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FLO導(dǎo)致魚紅細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重的DNA損傷，而具體機(jī)制尚不明確[18]。Ren等(2017年)以梭子蟹為對象研究了FLO的毒副作用，結(jié)果顯示，F(xiàn)LO可顯著抑制肝胰腺的抗氧化水平，F(xiàn)LO同時(shí)誘導(dǎo)了梭子蟹解毒基因及相應(yīng)酶的高表達(dá)；高劑量的FLO導(dǎo)致生物分子發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[19]。

4 毒副作用機(jī)制

研究表明，古細(xì)菌在長期進(jìn)化過程中與其寄生的宿主細(xì)胞達(dá)成了互利共生狀態(tài)，最終演化成了線粒體[20]。線粒體大約含有1 500種蛋白質(zhì)，其中線粒體基因組(mtDNA)編碼了13種參與氧化磷酸化的酶類，其他大部分蛋白質(zhì)由核基因組(nDNA)編碼，并轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。其中，mtDNA編碼的蛋白質(zhì)由線粒體核糖體翻譯，而nDNA編碼的蛋白質(zhì)則由細(xì)胞質(zhì)核糖體翻譯。緣于線粒體核糖體與細(xì)菌核糖體在起源及結(jié)構(gòu)上的相似性，故而許多靶向細(xì)菌線粒體的抗菌藥物在發(fā)揮抗菌作用的同時(shí)便不可避免地抑制了真核細(xì)胞線粒體核糖體的翻譯功能。正常情況下，這些nDNA編碼的線粒體蛋白質(zhì)和mtDNA編碼的多肽/蛋白質(zhì)進(jìn)行同步的、配套的翻譯后折疊、組裝過程，進(jìn)而形成線粒體呼吸鏈復(fù)合體。在此過程中，如果由nDNA和mtNDA編碼的線粒體蛋白質(zhì)發(fā)生比例失衡，造成線粒體呼吸鏈復(fù)合體不能正確組裝，則會造成線粒體的蛋白毒性應(yīng)激和代謝應(yīng)激[21]。當(dāng)線粒體受到如蛋白毒性、滲透性變化及氧化應(yīng)激等的影響而發(fā)生線粒體應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)多種由線粒體到細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如線粒體生物合成、線粒體自噬及線粒體未折疊蛋白反應(yīng)等能夠活化以緩解線粒體應(yīng)激并維持線粒體功能。而當(dāng)這些通路發(fā)生慢性、持續(xù)性活化后，則會導(dǎo)致線粒體毒性及功能異常。而越來越多的研究證實(shí)，線粒體除了為細(xì)胞供能外，還參與諸如鈣穩(wěn)態(tài)、生熱作用、類固醇生成、解毒作用、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞死亡等諸多生命活動過程并發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[22]，因此線粒體損傷在FLO誘導(dǎo)的機(jī)體毒副作用中應(yīng)該發(fā)揮重要作用。目前已報(bào)道的可造成線粒體損傷并引發(fā)機(jī)體毒副作用的抗菌藥物包括氨基糖苷類藥物、四環(huán)素類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物及氯霉素等[23-24]。我們前期在細(xì)胞水平研究了FLO對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響及線粒體損傷對細(xì)胞生命活動的影響，結(jié)果顯示， FLO可造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，并通過活化能量應(yīng)激蛋白AMPK，激活mTOR/p70S6K信號通路；同時(shí)p53/p21通路也被活化，導(dǎo)致了細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1阻滯和增殖抑制。此外，功能異常的線粒體導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧(ROS)升高，ROS引起的p53表達(dá)上調(diào)抑制了線粒體自噬蛋白Parkin向損傷線粒體的轉(zhuǎn)位過程，阻礙了線粒體自噬的進(jìn)行，致使損傷線粒體在細(xì)胞內(nèi)大量累積，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖并誘發(fā)了細(xì)胞早衰[25]。盡管目前已經(jīng)明確FLO對線粒體蛋白質(zhì)合成及線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響，但FLO造成機(jī)體毒副作用特別是免疫毒性和胚胎發(fā)育毒性的分子病理機(jī)制尚需深入研究。

5 展望

FLO作為目前獸醫(yī)臨床及水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中適用范圍最廣、使用量最大的抗菌藥之一，在使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制使用的時(shí)間和劑量，不能濫用，更不能亂用；應(yīng)注意藥物的聯(lián)合使用及合理配伍，盡可能做到科學(xué)合理用藥并減少毒副作用及耐藥性的發(fā)生。需特別注意的是，由于本品具有胚胎毒性，妊娠期及哺乳期家畜應(yīng)慎用，家禽在產(chǎn)蛋期應(yīng)禁用；且本品具有造血免疫毒性，雖然不會引起再生障礙性貧血，但其引起的可逆性紅細(xì)胞生成抑制和免疫抑制作用比氯霉素更常見，疫苗接種期或免疫功能嚴(yán)重受損的動物宜禁用。此外，為進(jìn)一步指導(dǎo)FLO的合理應(yīng)用，并為新藥研發(fā)提供依據(jù)，深入研究和闡明FLO毒副作用的機(jī)制，特別是FLO所致的免疫毒性和胚胎發(fā)育毒性，將成為藥理學(xué)與毒理學(xué)領(lǐng)域新的課題。