A群牛輪狀病毒膠體金免疫層析快速診斷方法的建立與初步應(yīng)用

曹 雷 , 崔曉辰 , 于志海 , 胡士林

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 , 山東 濰坊 261061 ; 2.濰坊科瑞斯生物科技有限公司 , 山東 濰坊 261061)

A群牛輪狀病毒腹瀉是由A群牛輪狀病毒(BRV)引起的，主要以仔牛厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征癥狀的疾病，給畜牧業(yè)帶來嚴重危害，消滅和控制該病已成為世界各國共同關(guān)注的課題。

膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是一種將膠體金標記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起的固相標記免疫檢測技術(shù)，目前用于檢測BRV抗原的研究在國內(nèi)尚未見報道。本試驗在制備輪狀病毒單克隆抗體的基礎(chǔ)上，用膠體金標記單克隆抗體，制備了A群牛輪狀病毒免疫膠體金抗原檢測試紙條，并初步進行應(yīng)用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及實驗動物 A群牛輪狀病毒、SP2/0骨髓瘤細胞均為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 氯金酸；HT、HAT、PEG-1 500及羊抗鼠IgG二抗；硝酸纖維素膜、吸水紙和玻璃纖維。A群牛輪狀病毒(BRV)標準陽性血清為本實驗室保存。

1.3 免疫用抗原制備 將BRV病毒OSU接種的MA-104細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，以8 000 r/min(4 ℃)離心30 min，而后取上清32 000 r/min超速離心2.5 h，棄上清，用PBS緩沖液浸泡沉淀，4 ℃過夜，期間反復(fù)吹打使其完全溶解。次日經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度離心(32 000 r/min離心2.5 h)棄上清，吸取各層懸液以PBS緩沖液懸浮，32 000 r/min超速離心3 h脫糖，棄上清，用PBS緩沖液溶解沉淀。電鏡觀察鑒定，紫外分光光度計測定蛋白含量，作為免疫原，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠免疫 將純化的BRV抗原加入等量的弗氏完全佐劑，用注射器充分乳化，腹腔注射6～8周齡的BALB/c 小鼠，每次免疫劑量約0.1 mL/只,第14、28天用弗氏不完全佐劑充分乳化的抗原進行第2次、第3次免疫，劑量同第1次。10 d后斷尾采血，間接ELISA法測其抗體效價并建立檢測方法。取抗體水平達到1 ∶10 000以上的小鼠用BRV抗原進行腹腔及尾靜脈加強免疫，3 d后取其脾細胞進行融合。

1.5 單克隆抗體的制備 采用常規(guī)方法進行細胞融合，有限稀釋法克隆3次，間接ELISA法篩選陽性克隆，參照文獻[1-2]進行。

1.6 標準陽性血清的純化 由本實驗室保存的BRV標準陽性血清采用飽和硫酸銨沉淀-透析法純化，間接ELISA法檢測抗體效價。

1.7 膠體金的制備 參照文獻[3-4]，氯金酸1 g裝，加三蒸水(電導(dǎo)率0.3 US/cm)定容至100 mL，室溫下溶解0.22 μm膜過濾，置4 ℃?zhèn)溆?。?% 氯金酸溶液1 mL，三蒸水稀釋至100 mL煮沸2 min后，在劇烈攪拌下，快速加入2 mL新配的1%檸檬酸鈉溶液(37 ℃ 預(yù)溫)，溶液由無色-藍色-淺藍色-紫色，當氯金酸變?yōu)樯罴t色后繼續(xù)煮沸6～8 min,至適宜濃度(OD525 nm值0.9312)或用蒸餾水調(diào)節(jié)OD值，冷卻后加入三蒸水恢復(fù)到原體積，用0.2 mol/L碳酸鉀調(diào)pH值至7.2～7.5(中性)。用0.22 μm 濾膜無菌注射器壓濾后置4 ℃保存。

1.8 金標單抗的制備 將待標記BRV單抗倍比稀釋，分別取100 μL加入到1 mL膠體金中，10 min后加入10%NaCl 100 μL,4 ℃靜止1 h。對照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1 mL膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標記蛋白質(zhì)的最低用量，在實際工作中，可適當增加10%～30%即為穩(wěn)定1 mL膠體金所需蛋白質(zhì)實際用量。同法對金標單抗最適pH值進行測定。取一定量膠體金溶液用0.2 mol/L K2CO3調(diào)最佳pH值，按最佳標記量加入BRV單抗，室溫作用30 min，加入Tris-Cl(pH值8.0，20 mmol/L)配制的BSA使終濃度為1%，4 ℃靜止2 h后使用[5]。

1.9 金標單抗的純化 將金標抗體復(fù)合物以1 200 r/min離心30 min，棄沉淀將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中(切忌傾倒)，12 000 r/min離心30 min棄上清，沉淀用1%BSA(Tris-HCI pH值8.0, 20 mmol/L配制)洗2遍，用1%BSA溶解沉淀并濃縮為原體積1/10(即5 mL),0.5 mg/mL疊氮鈉防腐，用0.45 nm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存。

1.10 膠體金試紙條的制備 金標單抗做一定倍數(shù)稀釋后，應(yīng)用XYZ-3000三維噴點儀中的Airjet噴制金標墊。純化的標準陽性血清用于檢測線(T)的顯示，羊抗鼠IgG二抗用于質(zhì)控線(C)的顯示。NC膜放于XYZ-3000三維噴點儀平臺上，標準陽性血清稀釋后放于樣品池B，羊抗鼠IgG二抗稀釋后放于樣品池C。開機后用Biojet1和B、C樣品池中的樣品分別點射于膜上形成2條線，置室溫自然干燥。將金標墊、NC膜、樣品墊及吸水濾紙按照圖1平貼于PVC支持板上，切成0.4 cm×10 cm的試紙條，加干燥劑密封保存。

圖1 膠體金免疫層析示意圖

1.11 判定標準 取待檢樣品100 μL滴加在樣品墊上，10 min內(nèi)觀察結(jié)果。如果在檢測線(T)和質(zhì)控線(C)上出現(xiàn)2條紅線，表示為陽性結(jié)果；如果只在對照線(C)上出現(xiàn)1條紅線，表示陰性結(jié)果；若沒有紅線出現(xiàn)表示該試驗失敗，需重新檢測。

1.12 敏感性檢驗 將純化的牛輪狀病毒10倍梯度稀釋到最低濃度為每毫升幾十納克，以此為樣品各取100 μL檢測，得出所能檢出的最低病毒量。同時用韓國進口的BRV抗原快速檢測試劑盒對樣品進行同步檢測，與本試驗制備的試紙條敏感性進行比較。

1.13 特異性檢驗 分別取牛輪狀病毒、冠狀病毒等抗原進行檢測，觀察結(jié)果。

1.14 現(xiàn)地試驗 對上海、廣州、內(nèi)蒙古、遼寧、河南等地牛場送檢的37份糞便病料進行處理，用試紙條檢測。同時用常規(guī)RT-PCR方法和BRV抗原快速檢測試劑盒檢測，比較三者檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細胞融合與克隆 用50%PEG-1 500做融合劑，采用傳統(tǒng)方法將免疫BRV小鼠脾細胞和處于對數(shù)生長期的SP/0骨髓瘤細胞進行融合。融合后第3天，可見單個雜交瘤細胞分裂5～7個不等的細胞集落；第10天雜交瘤細胞集落占培養(yǎng)孔的50%。細胞融合率可達100%，用建立的間接ELISA法共檢出陽性克隆20株，陽性率為20%。對陽性孔進行擴大培養(yǎng)和亞克隆，最終獲得5株能夠穩(wěn)定分泌抗BRV單克隆抗體的雜交瘤細胞系，分別命名為1D5，1B5，1G9，1C7和3C10。

2.2 BRV單克隆抗體的鑒定 間接ELISA檢測其細胞培養(yǎng)上清效價分別為1 ∶40，1 ∶40，1 ∶320，1 ∶160和1 ∶160，腹水效價分別為1 ∶800，1 ∶3 200，1 ∶12 800，1 ∶6 400和1 ∶3 200。亞型鑒定結(jié)果顯示，1D5，1B5和1C7為IgM型，1G9和3C10為IgG2b型，其輕鏈均為κ鏈(見封二彩版圖3)。Western Blot試驗表明，1D5，1G9和1C7能夠與BRV VP6蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，1B5和3C10能夠特異的與BRV VP7發(fā)生反應(yīng)(見封二彩版圖2)。我們選擇效價較高的1G9單克隆細胞株大量制備腹水，并用飽和硫酸銨沉淀-透析法進行純化，最終獲得單抗蛋白量為6.345 mg/mL。

2.3 膠體金標記抗體最適穩(wěn)定量的測定 根據(jù)待標記抗體蛋白的要求，將膠體金調(diào)pH值9.0左右，分裝11管，每管1 mL。將抗體以0.005 mol/L NaCl做系列稀釋，另設(shè)2管對照(表1)。試驗觀察結(jié)果：待標抗體96倍稀釋時達到最低穩(wěn)定量，此時抗體蛋白濃度為66.1 μg/mL，即金標抗體最適穩(wěn)定量為8.57 μg/mL膠體金。將未標記的膠體金顆粒與標記后的金顆粒進行光度掃描，未標記的膠體金顆粒最大吸光值在525 nm，而標記后的最大吸光值在530 nm，最大吸光值增大了5 nm，說明膠體金顆粒表面成功附著了蛋白，成功標記。

表1 膠體金標記抗體最適穩(wěn)定量的測定

2.4 膠體金標記抗體最適pH值的測定 取膠體金溶液100 μL，以0.2 mol/L K2CO3將pH值調(diào)為10、9.6、9.3、9.0、8.6、8.3、8.0，另設(shè)一管對照(表2)。根據(jù)已測定金標抗體最適穩(wěn)定量調(diào)節(jié)待標抗體濃度，各取10 μL加到上述膠體金溶液中混勻。5 min后，在上述各管中除對照管各加入10 μL 10%NaCl溶液，混勻后靜置2 h，觀察結(jié)果，保持紅色的最低pH值為9.0。

表2 膠體金標記抗體最適pH值的測定

2.5 硝酸纖維膜封閉液的選擇及濃度確定 以BSA、脫脂乳2種溶液為備選材料，依據(jù)金標復(fù)合物通過硝酸纖維膜時間和反應(yīng)后背景顏色為標準，時間短且背景淺為最佳(表3)。本試驗選擇3% BSA為封閉液。

表3 硝酸纖維素膜封閉液的選擇及濃度確定

2.6 高免陽性血清及羊抗鼠IgG二抗包被濃度確定 用pH值8.0, 20 mmol/L的Tris -HCl緩沖液稀釋A群牛輪狀病毒標準陽性血清，以10 μg/mL的間隔，50 μg/mL到100 μg/mL，印跡于硝酸纖維素膜上(檢測點)，以0.8 mg/mL的羊抗鼠IgG抗體印跡于硝酸纖維素膜上(質(zhì)控點)，制作成試紙條，對不同稀釋濃度的A群牛輪狀病毒做方陣試驗，確定A群牛輪狀病毒標準陽性血清的最適印跡量為62.5 μg/mL(表2)。同時，用最適濃度的A群牛輪狀病毒標準陽性血清印跡于硝酸纖維素膜上作為檢測點，以同樣方法確定羊抗兔IgG抗體的最適印跡量，結(jié)果同表4相近，約為80 μg/mL。

表4 多抗最適印記量選擇

2.7 金標單抗包被濃度確定 將金標單抗溶液用Tris-Cl緩沖液按1、2、4、8倍梯度稀釋，分別包被玻璃纖維膜。對不同稀釋濃度的同一批A群牛輪狀病毒做方陣試驗，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，確定金標單抗2倍稀釋為最佳(表5)。

表5 不同稀釋度的金標單抗與不同稀釋度BRV的方陣試驗

2.8 試紙條的組裝及檢測結(jié)果 用純化的1G9小鼠腹水單抗制備金標單抗，組裝試紙條。在樣品墊上滴加約100 μL樣品，10 min后觀察，結(jié)果如中插彩版圖4。由封二彩版圖4可見，含有BRV抗原的陽性樣品在試紙條檢測線(T)和質(zhì)控線(C)處分別出現(xiàn)1條紅色線；未接BRV抗原的陰性樣品只在試紙條質(zhì)控線(C)處出現(xiàn)1條紅線。

2.9 試紙條的敏感性及特異性試驗 如表6所示，該試紙條的最低檢出量約為5.341 μg/mL。與韓國進口BRV抗原快速檢測試劑盒相比：抗原濃度為5.341 μg/mL樣品的試劑盒檢測結(jié)果比試紙條要明顯些，但在抗原濃度為5.341×10-1μg/mL時檢測結(jié)果均為陰性。這說明該試紙條敏感性稍差于國外進口試劑盒。用牛冠狀病毒及Tris-Cl緩沖液等進行特異性試驗，只有BRV樣品呈現(xiàn)陽性，即該試紙條具有良好的特異性。

表6 試紙條敏感性試驗結(jié)果

2.10 試紙條穩(wěn)定性試驗 該試紙條至于室溫下、60 ℃溫箱及4 ℃冰箱各保存20 d，再用含有BRV抗原的樣品進行檢測，結(jié)果無明顯差異。

2.11 現(xiàn)地試驗 對地方牛場送檢的37份糞便病料進行了試紙條檢測，同時與常規(guī)RT-PCR方法和BRV抗原快速檢測試劑盒相比較,結(jié)果如表7,在37份待檢病料中，試紙條方法檢出11份為陽性，常規(guī)RT-PCR方法檢出17份陽性，BRV抗原快速檢測試劑盒檢出12份陽性。其中，內(nèi)蒙古、遼寧和河南等地牛場的7份病料病毒含量比較高，3種方法均檢為陽性；而廣州某牛場的13份病料中，常規(guī)RT-PCR方法檢出2份為陽性，且病毒含量很低，其他二種方法未檢出。這說明本試驗制備的膠體金免疫層析試紙條比較可靠。

表7 現(xiàn)地試驗結(jié)果

3 討論

國外Engler及Putalun分別研究了檢測白喉毒素等成分的免疫層析試紙條[8-9]；寵物疾病免疫層析試紙條診斷方法已經(jīng)得到推廣[10],國內(nèi)黃印堯、于相龍等人分別研制了檢測牛瘟和鵝細小病毒的膠體金試紙條[11-12]。這為膠體金技術(shù)成功應(yīng)用于動物疾病診斷提供了堅實基礎(chǔ)。本試驗結(jié)合單克隆抗體技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)，于國內(nèi)首次研制出A群牛輪狀病毒膠體金免疫層析快速診斷試紙條，為提前預(yù)防和控制A群牛輪狀病毒腹瀉暴發(fā)提供強有力手段。該試紙條具有微量、敏感、特異、快速、簡便等特點，全過程只需10 min左右，無需任何輔助設(shè)備，非常適合現(xiàn)地檢測，為廣大畜主提供了一種前所未有的診斷方法,方便了疫病檢測,提高了養(yǎng)殖的技術(shù)水平,促進了養(yǎng)殖經(jīng)濟的發(fā)展。

目前，國內(nèi)外關(guān)于輪狀病毒單克隆抗體的研究已有相關(guān)報道。有報道指出，針對于G3血清型輪狀病毒株VP7蛋白不同抗原決定簇的兩株單克隆抗體只能對G3血清型的輪狀病毒起到保護作用[6]，即輪狀病毒單克隆抗體不同血清型之間交叉保護性較弱；而針對于群抗原VP6蛋白的單克隆抗體對群內(nèi)其他毒株的同樣起到保護作用[7]，即輪狀病毒單克隆抗體具有群特異性。A群牛輪狀病毒屬于A群、G5血清型輪狀病毒，是典型的輪狀病毒，各牛場感染率幾乎最高。本試驗利用實驗室現(xiàn)有的BRV，建立能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，為BRV膠體金快速診斷試劑盒的研制提供特異、敏感、穩(wěn)定的診斷試劑。