噻拉嗪對(duì)大鼠離體腦神經(jīng)元ATP酶活性影響的研究

陳 宇 ， 杜雪曼 ， 連慧敏 ， 唐賽男 ， 劉文瀚 ， 趙菁華 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

ATP酶廣泛分布于腦組織中，有學(xué)者認(rèn)為其可調(diào)節(jié)多數(shù)細(xì)胞的活性。其中Na+-K+-ATP酶主要在調(diào)節(jié)神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)、離子穩(wěn)態(tài)、肌肉收縮等方面發(fā)揮重要作用[1]；而細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶能使胞漿內(nèi)Ca2+維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)從而使神經(jīng)系統(tǒng)功能正常。

噻拉嗪(Xylazine，2，6-二甲苯胺噻嗪)通過(guò)直接作用于α-2型腎上腺素能受體產(chǎn)生中樞抑制作用從而起到麻醉作用[2]。經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，噻拉嗪使用后肌松效果良好，且在安全用藥范圍內(nèi)，藥物效果會(huì)隨著劑量的增加而逐步加強(qiáng)。而噻拉嗪對(duì)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化的情況鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)噻拉嗪對(duì)離體神經(jīng)元中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化來(lái)探討噻拉嗪麻醉機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠30只，質(zhì)量180～220 g；孕16～18 d的Wistar大鼠5只，質(zhì)量230～270 g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要藥品與試劑 噻拉嗪，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室提供；胎牛血清(FBS，16140071，Invitrogen)；青鏈霉素(15140122，Invitrogen)；胰酶(LS003707，Worthington)；Mouse anti-MAP2 antibody(13-1500)；PBS(pH值為7.4，10010-023，Gibco)；細(xì)胞裂解液(北京賽馳生物科技有限公司)；考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒、超微量ATP酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ProLong Gold antifade(P36934,Invitrogen)。

1.3 試驗(yàn)儀器 Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Symmetry C18(4.6×150 mm，5 μm)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；離心機(jī)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sartorius公司)；75 μm細(xì)胞濾網(wǎng)(昆山市超聲儀器有限公司)；手術(shù)器械，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)外科教研室提供。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

1.4.1 神經(jīng)元的培養(yǎng) 培養(yǎng)板在紫外線下照射0.5 h。隨后，培養(yǎng)板底部由足量聚左旋賴氨酸覆蓋，混勻并放置過(guò)夜。將懷孕大鼠斷頸處死，常規(guī)手術(shù)消毒，開腹，從子宮中取出胎鼠并斷頸處死，將完整腦組織放入分離培養(yǎng)液中進(jìn)行皮質(zhì)的分離(分離過(guò)程中需確保腦組織完全浸在分離液中)。將組織剪碎(大小約為1 mm3)后置于15 mL離心管中，待所有組織沉底后棄去85%～90%液體，然后再加入10 mL新分離液。組織沉底后棄去分離液，重復(fù)2次。將組織懸浮在4.5 mL新分離液中，加入0.5 mL胰蛋白酶液，輕柔混勻。37 ℃水浴鍋中消化5～10 min。加入接種培養(yǎng)基終止消化，用長(zhǎng)槍頭輕柔吹打10次后1 000 r/min離心5 min。吸凈上清液后用2 mL接種培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，洗滌2次。視消化組織黏稠程度加入0.1～0.5 mL的DNA酶，室溫處理5 min。

用長(zhǎng)槍頭輕柔吹打組織8～10次，使細(xì)胞分散進(jìn)而制得細(xì)胞懸液。將分散的細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基進(jìn)行10倍稀釋。在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上估算活性細(xì)胞的密度。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，在6孔板上加細(xì)胞，密度為105～106個(gè)/mL(須均勻接種到培養(yǎng)板上)。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h后，從每個(gè)孔中吸出培養(yǎng)基，再向每個(gè)孔中加入2 mL 37 ℃維持培養(yǎng)基。隨后，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱里37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。接種后2 d加入終濃度為1～5 μmol/L胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷；1-b-D阿糖呋喃胞嘧啶)來(lái)抑制非神經(jīng)元增殖，1周2次，每次棄掉一半培養(yǎng)基，再加入相同體積新培養(yǎng)基。

1.4.2 神經(jīng)元的鑒定 將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液緩慢吸出，然后快速加入37 ℃多聚甲醛與蔗糖的混合液1 mL，置于室溫10 min。多聚甲醛與蔗糖混合液吸出后，加入0.1%的TritonX-100 1 mL到培養(yǎng)孔中，室溫放置10 min。PBS輕柔浸洗玻片后加5%牛血清白蛋白1 mL，置于室溫1 h。在載玻片上滴加MAP-2后4 ℃過(guò)夜。用PBS浸洗載玻片3次，每次3 min，然后滴加二抗并室溫放置1 h；再用PBS浸洗載玻片3次。在一側(cè)滴入1滴抗褪色封固液(ProLong Gold antifade)，將含細(xì)胞一側(cè)向下，清除多余封固液。載玻片避光放置1 h后置于顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞給藥濃度測(cè)定 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：低劑量組(D組)，麻醉組(M組)，高劑量組(G組)。D組腹腔注射噻拉嗪10、20、30、40 mg/(kg·bw)，M組腹腔注射噻拉嗪50、60、70、80、90、100 mg/(kg·bw)，G組腹腔注射噻拉嗪150、200、300 mg/(kg·bw)，每個(gè)濃度3個(gè)平行，心臟采血，高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)血藥濃度。根據(jù)噻拉嗪在大鼠血藥濃度檢出值設(shè)立濃度梯度從而確定噻拉嗪在離體培養(yǎng)神經(jīng)元的藥物濃度。

1.6 樣品的采集與酶活性的檢測(cè) 根據(jù)噻拉嗪在Wistar大鼠麻醉過(guò)程中的血藥濃度檢測(cè)值，確定其作用于神經(jīng)細(xì)胞的濃度為15，25，35 μg/mL和45 μg/mL。培養(yǎng)神經(jīng)元第8天時(shí)加入不同濃度噻拉嗪，每個(gè)濃度做3個(gè)平行試驗(yàn)。分別在加藥后0、5、10、15、20、25、30、45、60、90 min和120 min進(jìn)行細(xì)胞裂解，離心后分別取上清液40 μL置于EP管中，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

應(yīng)用分光光度法測(cè)定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，二者酶活性檢測(cè)均使用超微量ATP酶測(cè)定試劑盒，具體試驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書。ATP可由ATP酶分解生成ADP及無(wú)機(jī)磷，因此，測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量即可判斷ATP酶活性的高低。組織或細(xì)胞中ATP酶活性可根據(jù)下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

細(xì)胞中ATPase活性(U/mgprot)=[(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.02 μmol/mL)×6*×7.8**÷勻漿蛋白濃度(mg/mL)

*：定義上為每小時(shí)，實(shí)際操作為10 min反應(yīng)；**：反應(yīng)體系中7.8倍稀釋；蛋白濃度由考馬斯亮蘭法測(cè)定

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“Mean ± SD”表示；兩變量間的簡(jiǎn)單相關(guān)性采用直線相關(guān)回歸分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞接種后連續(xù)8 d在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。接種3 h后可見貼壁的神經(jīng)元大小均一，胞體為圓形，分散均勻，包體周圍有光暈包圍(圖1)；培養(yǎng)至第4天，從形態(tài)學(xué)上未見其他雜質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元胞體變長(zhǎng)，形態(tài)隨突起的方向延伸，細(xì)胞間隱約出現(xiàn)突起交織狀(圖2)；培養(yǎng)至第8天，胞體成熟，突起充分延展且清晰，特征形態(tài)明顯(圖3)。

圖2 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)4 d (200×)

圖3 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)8 d (200×)

2.1.2 神經(jīng)元的鑒定 將培養(yǎng)第8天的神經(jīng)元進(jìn)行MAP-2免疫熒光鑒定。顯微鏡下觀察可見神經(jīng)元呈現(xiàn)熒光綠色，其中存在大量神經(jīng)元，突起清晰且延展充分、形態(tài)良好、呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)(見封三彩版圖4)。

2.2 不同濃度噻拉嗪對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響 如表1所示，4種不同濃度噻拉嗪(15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL)使Na+-K+-ATP酶活性均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。25 min時(shí)，15 μg/mL，25 μg/mL和45 μg/mL 3組的Na+-K+-ATP酶活性為最低值，與0 min相比分別降低了63.72%，66.77%和64.63%(P<0.01)。隨后這3組酶活性逐漸上升，其中15 μg/mL和45 μg/mL最高值均出現(xiàn)在60 min，與25 min時(shí)相比分別升高188.9%和181.8%(P<0.01)，25 μg/mL組在120 min時(shí)最高，與25 min相比上升208.4%(P<0.01)，與0 min相比差異不顯著(P>0.05)。35 μg/mL組Na+-K+-ATP酶活性在15 min時(shí)降為最低值，下降了67.04%(P<0.01)，之后酶活性逐漸恢復(fù)，在120 min時(shí)最高，與15 min相比上升196.2%(P<0.01)，與0 min相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同濃度噻拉嗪對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響

2.3 不同濃度噻拉嗪對(duì)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 如表2所示，15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在不同的作用時(shí)間均受到抑制。15 μg/mL，25 μg/mL，35 μg/mL和45 μg/mL組Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在25 min時(shí)降至最低值，較0 min降低了42.81%，68.91%，87.67%和80.14%(P<0.01)。隨后Ca2+-Mg2+-ATP酶活性上升，15 μg/mL組在60 min時(shí)為最高值，與25 min相比上升46.95%(P<0.01)，與0 min比差異不顯著(P>0.05)；25 μg/mL，35 μg/mL和45 μg/mL的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在120 min時(shí)，與最低值比分別上升了104.2%，420%和170.8%(P<0.01)。

表2 不同濃度噻拉嗪對(duì)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

3 討論

Na+-K+-ATP酶(又稱Na+-K+泵)是一種普遍存在的P型ATP驅(qū)動(dòng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它可以將2個(gè)K+和3個(gè)Na+交換出細(xì)胞，從而建立穿過(guò)質(zhì)膜的細(xì)胞工作電位。這種梯度對(duì)維持神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉收縮具有至關(guān)的重要[3]。有學(xué)者研究認(rèn)為，異氟醚、氯胺酮和氯丙嗪等麻醉藥對(duì)中樞抑制作用可能與大腦皮質(zhì)內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性下降有關(guān)[4-5]。此外，胡興國(guó)等[6]研究異丙酚能使大腦皮層、腦干及海馬突觸體中的Na+-K+-ATP酶活性下降，從而發(fā)揮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。同時(shí)研究表明，烏頭堿能影響離體SD大鼠腦組織細(xì)胞中Na+、K+、Ca2+、Mg2+濃度而使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變以及功能受損[7]。

本試驗(yàn)中，不同濃度的(15、25、35 μg/mL和45 μg/mL)噻拉嗪作用離體神經(jīng)細(xì)胞后，各組Na+-K+-ATP酶活性都表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)，60 min到120 min酶活性逐漸恢復(fù)至0 min時(shí)水平。25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL這3組較15 μg/mL組出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)。有研究表明，這主要是由于藥物對(duì)Na+-K+-ATP酶的作用通過(guò)其不同亞基結(jié)構(gòu)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)[8]，前期研究發(fā)現(xiàn)，噻拉嗪能有效抑制麻醉期鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性，其活性變化可能與噻拉嗪麻醉效果的產(chǎn)生有一定關(guān)系[9]。噻拉嗪對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響顯著，可能是由于中樞抑制與神經(jīng)元Na+-K+-ATP酶活性變化存在著關(guān)系。

Ca2+-Mg2+-ATP酶在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平發(fā)揮重要作用，神經(jīng)元的活動(dòng)也依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。諸多研究表明，不同類型的麻醉藥均能使Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低從而實(shí)現(xiàn)麻醉作用[10-11]。當(dāng)噻拉嗪作用濃度為15 μg/mL，作用時(shí)間10 min時(shí)，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)，隨后逐步恢復(fù)到空白組水平，無(wú)顯著差異。25 μg/mL、35 μg/mL、45 μg/mL組的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性都表現(xiàn)為先下降后回升，25 min時(shí)噻拉嗪對(duì)酶活性的抑制作用最為明顯，活性值最低，在120 min時(shí)，其仍對(duì)神經(jīng)細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性抑制作用顯著(P<0.01)。主要是因?yàn)猷缋鹤饔糜谏窠?jīng)元后，抑制了Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，胞內(nèi)Ca2+大量蓄積，穩(wěn)態(tài)失衡，使得神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位發(fā)生變化，從而發(fā)揮中樞抑制作用。然而隨著麻醉時(shí)間延長(zhǎng)，藥物在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生代謝，藥物的有效濃度下降，對(duì)中樞抑制作用減弱。韓光[12]通過(guò)研究山羊使用噻拉嗪麻醉的藥物代謝動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，在噻拉嗪麻醉90 min之后，山羊麻醉深度減弱，逐漸蘇醒，此時(shí)血藥濃度為56.6 ng/mL，對(duì)動(dòng)物的麻醉效果較差，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。與此同時(shí)，研究證實(shí)異氟醚可以明顯抑制丘腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞膜T-型鈣通道的峰電流[13]，隨后的生物物理學(xué)研究指出這種抑制在細(xì)胞膜去極化時(shí)更易發(fā)生。

4 結(jié)論

噻拉嗪通過(guò)顯著降低Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性來(lái)發(fā)揮麻醉作用，其作用機(jī)制可能與改變神經(jīng)元胞內(nèi)外的離子平衡狀態(tài)有關(guān)。