玉米中4種交鏈孢霉毒素的測定方法研究

蘇 爽，張二鵬，韓月哲，張榕杰*，韓華云，賀 靜

1.鄭州大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001

2.河南省疾病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450016

交鏈孢霉毒素是由交鏈孢霉產(chǎn)生的一類真菌毒素，主要包括細(xì)交鏈孢菌酮酸(TeA)、交鏈孢酚(AOH)、交鏈孢酚單甲醚(AME)和騰毒素(TEN)。近年來對交鏈孢霉毒素的研究表明其對人畜的健康均有影響：TeA可引起急性毒性，微克劑量可引發(fā)雞胚胎死亡，且與非洲血液病有關(guān)；TEN可使多種植物產(chǎn)生萎黃病；AOH和AME具有遺傳毒性，可能導(dǎo)致細(xì)胞誘變及轉(zhuǎn)化[1-3]。韓小敏等[4]通過對人食管上皮細(xì)胞Het-1 A的體外毒性研究發(fā)現(xiàn)，這4種毒素可通過抑制細(xì)胞增殖引起細(xì)胞凋亡。

目前，國內(nèi)外還沒有食品中交鏈孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[5]，但是在小麥、蔬菜、水果及其制品中均檢出了該類毒素[6-8]。安徽省新收割的小麥籽粒中交鏈孢霉毒素TeA檢出率為100%，最大檢出的含量為3 330.7 μg/kg[9]；在番茄醬和番茄汁中TeA檢出率為100%，在柑橘汁中也檢出TeA和AME[10]；在市售的新鮮櫻桃和櫻桃醬中4種毒素均有檢出，新鮮櫻桃中TeA最高含量為236.58 μg/kg[11]。隨著全球氣候的加速轉(zhuǎn)變以及環(huán)境污染的加重，糧食作物等受到真菌污染的概率越來越大，霉菌污染糧食已經(jīng)成為全球性的問題[12]。玉米是三大主糧之一，我國已經(jīng)成為全球玉米第二生產(chǎn)大國[13]。玉米作為畜禽飼料的主要原料，其生產(chǎn)安全在動(dòng)物性食品供應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。目前對玉米毒素的研究主要集中于黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮，對交鏈孢霉毒素的研究較少，因此建立相應(yīng)的檢測方法并對玉米及其相關(guān)食品的安全進(jìn)行調(diào)查非常重要。

交鏈孢霉毒素的測定方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-17]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)具有更高的分離能力、選擇性和靈敏度，近年來受到廣泛關(guān)注。作者通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合固相萃取前處理技術(shù)，建立了玉米中4種交鏈孢霉毒素(TeA、AOH、TEN和AME)的測定方法，研究了不同淋洗液與洗脫液的組合對目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率的影響，并用于實(shí)際樣品測定。

1 材料和方法

1.1 材料

TeA、AOH、TEN、AME標(biāo)準(zhǔn)品溶液購自ROMER Labs，規(guī)格分別為100.9、100.3、100.5、100.3 mg/L乙腈溶液；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑為分析純，試驗(yàn)用水均為超純水。

玉米粒(10份)、玉米面(10份)、玉米糝(17份)、玉米碴(10份)購自鄭州市超市及農(nóng)貿(mào)市場，采集時(shí)間為2018年10月。采樣后用研磨機(jī)粉碎、過篩，置于-20 ℃下避光保存，待測。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30 A超高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司；QTRAP 6500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司；Multi Reax振蕩器：德國Heidolph公司；SORVALL LYNX 6000高速落地離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；N-Evap 112氮吹儀：美國Organomation公司；Milli-Q A10 超純水器：美國Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，6cc)、XBridge BEH C18色譜柱：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)待測樣于50 mL離心管中，加入25 mL提取液(V0.05 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH3.0)∶V甲醇∶V乙腈=45∶10∶45)，渦旋30 s后振蕩提取60 min。4 ℃低溫離心(10 000 r/min)，取上清液5 mL加入15 mL磷酸二氫鈉緩沖液稀釋，混合均勻，離心，待凈化。HLB固相萃取柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化，將樣品稀釋液全部過柱，用5 mL 20%甲醇水溶液淋洗，抽干后用6 mL含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,體積比)混合液洗脫小柱。洗脫液在40 ℃的氮?dú)饬飨麓抵两?，殘?jiān)? mL 10%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋30 s后，離心，上清液供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液，用乙腈配制成TeA、AOH、TEN為500 μg/L，AME為50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后用10%甲醇稀釋配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，TeA、AOH、TEN質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，AME質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L。

基質(zhì)匹配工作曲線：取陰性玉米樣品，用1.3.1方法處理得到空白基質(zhì)溶液，取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋配制基質(zhì)匹配工作曲線，其中TeA、AOH、TEN質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，AME質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L。

1.3.3 液相條件

色譜柱：XBridge BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.5 mL/min；流動(dòng)相(A)1.0 mmol/L碳酸氫銨水溶液和(B)甲醇；梯度洗脫：0～1.0 min，5%B；1.0～1.5 min，5%-75%B；1.5～2.0 min 75%-90% B；2.0～4.0 min，90%B；4.0～4.2 min，95%-5%B；4.2～9.0 min，5%B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，負(fù)離子模式(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子化電壓：-4 500 V；氣簾氣(Curtain Gas)：241.3 kPa；溫度：550 ℃；噴霧氣(Gas1)：344.7 kPa；輔助加熱氣(Gas 2)：413.7 kPa；碰撞氣：Medium。4種交鏈孢霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 交鏈孢霉毒素的質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

TeA是一元酸類化合物(pKa=3.5)，與AOH和AME極性相差較大，需要選擇合適的分離條件[18]。研究了CORTECS C18、BEH C18、HSS T3和XBridge BEH C184種色譜柱，以及甲醇-1.0 mmol/L氨水和甲醇-1.0 mmol/L碳酸氫銨水溶液分別作為流動(dòng)相對4種毒素分離和檢測的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-1.0 mmol/L氨水作為流動(dòng)相，使用CORTECS C18和HSS T3色譜柱，TeA峰形拖尾；使用BEH C18色譜柱，TeA保留能力差，出峰太快，目標(biāo)化合物的電離易受影響。甲醇-1.0 mmol/L碳酸氫銨做流動(dòng)相，使用BEH C18色譜柱，4種化合物峰形均出現(xiàn)拖尾的情況；分別使用HSS T3和XBridge BEH C18色譜柱時(shí)4種交鏈孢霉毒素的峰形較好?？紤]到HSS T3柱pH值(2～8)耐受范圍較窄，而XBridge BEH C18柱pH值(2～12)適用范圍廣，最終選用XBridge BEH C18做分離柱，甲醇-1.0 mmol/L碳酸氫銨做流動(dòng)相。

通過流動(dòng)注射泵直接進(jìn)樣的方式，在ESI-模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，對去簇電壓和錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，確定準(zhǔn)分子離子峰。接著進(jìn)行目標(biāo)離子二級質(zhì)譜掃描，優(yōu)化碰撞電壓和碰撞室出口電壓，得到碎片離子。選擇穩(wěn)定性好、豐度高的兩個(gè)碎片離子分別作為定性離子和定量離子，并以豐度最強(qiáng)，響應(yīng)最高的離子作為定量離子，見表1。

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

固相萃取過程中淋洗液及洗脫液的溶劑種類和比例對試驗(yàn)結(jié)果影響很大[10-11]，分別優(yōu)化了3種淋洗方式和兩種洗脫方式。淋洗：(1)依次用5 mL 20%甲醇、5 mL含1%甲酸的20%甲醇水溶液和5 mL水淋洗；(2)用5 mL含1%甲酸的20%甲醇水溶液淋洗；(3)用5 mL 20%甲醇水溶液淋洗。洗脫：(1)用5 mL甲醇和5 mL乙腈依次洗脫；(2)用6 mL含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,體積比)混合溶液洗脫。

試驗(yàn)結(jié)果見表2。采用淋洗方式3與洗脫方式1組合，發(fā)現(xiàn)TeA和TEN的回收率滿足要求，AOH和AME回收率較差；采用淋洗方式3與洗脫方式2組合，AOH和AME回收率均達(dá)到70%以上。當(dāng)采用淋洗方式1與洗脫方式2組合時(shí)，發(fā)現(xiàn)AOH和AME也能滿足要求，但是結(jié)果穩(wěn)定性較差。故而確定20%甲醇水溶液為淋洗液，含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,體積比)混合溶液為洗脫液。

表2 不同固相萃取處理方法對4種交鏈孢霉毒素回收率的影響

進(jìn)一步研究了洗脫液體積對試驗(yàn)結(jié)果的影響。取5 mL空白基質(zhì)溶液，向其中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液(TeA、AOH、TEN為100 μg/kg，AME為10 μg/kg)，稀釋后上樣、凈化，用10 mL洗脫液分5次對小柱進(jìn)行洗脫，每次2 mL，分別收集洗脫液，氮吹，定容到2.0 mL，上機(jī)檢測。結(jié)果顯示，第4次和第5次的洗脫液中不含任何待測物，說明6 mL洗脫液可以把樣品完全洗脫出來。

2.3 方法評價(jià)

對分析方法的特性進(jìn)行了評估，結(jié)果見表3。TeA、AOH、TEN在1.0～100.0 μg/L、AME在0.1～10.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r>0.999)。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以信噪比為3∶1和10∶1進(jìn)行計(jì)算。

表3 分析方法的特性

為確定方法的準(zhǔn)確性，對4種化合物進(jìn)行了低、中、高三水平加標(biāo)回收率測定，每個(gè)加標(biāo)水平下平行測定6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。4種化合物的平均回收率為78.4%～100.3%，RSD≤8.9%，表明該方法對玉米中4種交鏈孢霉毒素的測定具有較高的回收率和精密度，準(zhǔn)確可靠。

表4 玉米樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率和精密度(n=6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)由基質(zhì)匹配工作曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比進(jìn)行計(jì)算[19]。由表3可知，4種毒素都有基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致信號變化大于20%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，而AOH和AME信號降低50%以上(圖1)，為了得到準(zhǔn)確的結(jié)果，采用基質(zhì)匹配工作曲線進(jìn)行校正。

注：A為10%甲醇，B為空白；TeA、AOH、TEN為50 μg/L，AME為5 μg/L；色譜峰1—4分別為TeA、AOH、TEN、AME。

2.5 樣品測定結(jié)果及污染情況分析

對47份玉米樣品進(jìn)行檢測，4種交鏈孢霉毒素均有檢出，測定結(jié)果見表5。有66.0%(31/47)的樣品至少受一種毒素污染，TeA、AOH、TEN和AME檢出率分別為23.4%、10.6%、4.3%和63.8%。TeA檢出的含量最高，為32.51 μg/kg。4種毒素平均含量為TeA>AOH>AME>TEN，Zhao等[20]報(bào)道小麥粉中4種毒素平均含量為TeA>AOH>TEN>AME，其中TEN的含量為16.0～98.7 μg/kg，而本次研究共采集47份玉米樣品，TEN的檢出率較低，平均含量為1.04μg/kg，可見該毒素在玉米中的污染情況和小麥有所不同。由表6可知，不同顆粒大小的玉米樣品AME毒素檢出率分別為玉米面100%、玉米糝88.2%、玉米碴30%、玉米粒20%，可見玉米面、玉米糝與玉米粒、玉米碴相比，毒素檢出率較高。此外，受4種毒素污染最為嚴(yán)重的是玉米面，其中TeA檢出率為90%，平均值為8.85 μg/kg；AME檢出率為100%，平均值為2.65 μg/kg。谷物粉碎后，沒有了表皮的保護(hù)，在適宜的環(huán)境下，霉菌很容易生長繁衍。因此糧食在收割及儲藏時(shí)盡量保持顆粒完整，且入庫前降到安全水分(≤14%)，降低儲藏濕度、溫度，以降低霉變風(fēng)險(xiǎn)[21]。

表5 玉米樣品中4種交鏈孢霉毒素的檢出情況(n=47)

表6 不同種類玉米中4種交鏈孢霉毒素陽性率

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定玉米中4種交鏈孢霉毒素的分析方法，4種毒素低中高加標(biāo)回收率為78.4%～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8.9%，該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，滿足玉米中4種交鏈孢霉毒素的檢測要求。對采集的47份玉米樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有66.0%(31/47)的樣品至少受一種毒素污染。玉米中4種毒素檢出的含量為TeA>AOH>AME>TEN，TeA毒素是玉米中檢出的主要毒素，TEN污染程度最低，與小麥粉中4種毒素污染情況有所不同。與玉米粒和玉米碴這種大顆粒樣品相比，玉米面污染最為嚴(yán)重，由此推測，樣品顆粒度越小，越易受霉菌污染。