不同產(chǎn)地浮小麥HPLC指紋圖譜研究

袁為玲，惠 明，田 青，黃繼紅

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

禾本科植物小麥干癟輕浮的穎果稱為浮小麥(FructusTriticiLevis)。浮小麥性涼，味甘甜，作用于腎、脾、心，可止汗、除熱、益氣，對自汗、盜汗、骨蒸勞熱等疾病有較好的療效[1-2]。臨床廣泛用于更年期潮熱、盜汗、自汗、兒童汗癥等疾病的治療[3-6]。浮小麥資源豐富，在我國華北、華東、華中、東北等地區(qū)均有產(chǎn)出，目前從中先后檢測出亞油酸、5-二十一烷基間苯二酚、棉籽糖、葡萄糖、微量元素等多種化學(xué)成分，由于各產(chǎn)地地理位置、生態(tài)環(huán)境等條件不同，造成不同產(chǎn)地浮小麥化學(xué)成分含量具有差異性[7-11]?！吨袊幍洹?015年版中收錄浮小麥配伍藥方的用量及使用方法，但未對浮小麥質(zhì)量控制提出明確要求[12]。在質(zhì)量評價過程中只采用單一或幾個指標不足以表現(xiàn)浮小麥的整體特性，故作者選用不同產(chǎn)地浮小麥，運用相似度評價、聚類分析、主成分分析等方法進行指紋圖譜分析[13-21]，以期為浮小麥質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12批不同產(chǎn)地的浮小麥樣品(表1)均從中藥店采購。

表1 浮小麥樣品的來源

乙腈、甲醇、磷酸(色譜級)：天津科密歐化學(xué)試劑公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；亞油酸(批號I1811018)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豆甾醇(批號C10206967)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C Plus高效液相色譜儀:日本島津公司；超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；多功能高速粉碎機:荷蘭皇家飛利浦電子公司；電子分析天平:賽多斯科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機:賽默飛世爾(中國)科技公司；分樣篩:浙江上虞五四儀器篩具廠。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精確稱取亞油酸、豆甾醇對照品適量，置于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，即得含有540 μg/mL豆甾醇、720 μg/mL亞油酸混合對照品的溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

精確稱取浮小麥1.000 g(過50目篩)，置于50 mL離心管并加入甲醇25 mL，在500 W、60 kHz超聲波下提取3次，每次30 min， 8 000 r/min離心15 min，取上清液，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘渣加入甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，并用甲醇定容，過0.22 um微孔濾膜，即得樣品溶液。

1.3.3 色譜條件

采用Material C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進行分離，流動相為乙腈溶液(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，45%-35% A；10～25 min，35%-25% A；25～40 min，25%-15% A；40～60 min，15%-10% A；60～70 min，10%-3% A)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，測定波長203 nm，進樣量20 μL。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

相似度評價采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，以S1為參照圖譜。使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗

取同一批S1樣品溶液，按照1.3.3的色譜條件連續(xù)進樣6次，以7號亞油酸為參照峰，考察儀器精密度。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.16%～1.89%、1.74%～2.22%，均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

取同一批S1樣品溶液6份，分別在0、2、6、8、12、24 h后按照1.3.3的色譜條件進樣測定，以7號亞油酸為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為1.23%～1.60%、1.01%～2.15%，均小于3.00%，說明樣品溶液在制備24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗

取同一批S1樣品溶液6份，按照1.3.3的色譜條件測定，以7號亞油酸為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為1.16%～1.25%、0.90%～1.90%，均小于3.00%，表明重復(fù)性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

將12批浮小麥的樣品溶液在1.3.3的色譜條件下測定，將所得色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，以S1樣品色譜圖為參照圖譜，選擇平均數(shù)法，時間寬度設(shè)置成0.1，多點校正后，進行共有峰自動匹配，生成樣品對照指紋圖譜和對照指紋圖譜R，見圖1、圖2，其中12批不同產(chǎn)地浮小麥共有色譜峰16個。通過與對照品進行比對，7號峰為亞油酸，11號峰為豆甾醇，見圖3。由于7號亞油酸峰分離度好，峰位居中，故以其為參照峰(S)計算其余共有峰的相對保留時間的RSD，均小于3.00%，表明共有峰的出峰時間較為穩(wěn)定，但其相對峰面積的RSD相差較大，表明不同產(chǎn)地浮小麥中各個成分含量存在一定差異性，見表2。

表2 各共有峰相對峰面積

圖1 12批浮小麥樣品色譜峰匹配圖

圖2 浮小麥樣品HPLC指紋圖譜共有模式

圖3 對照品HPLC色譜圖

2.3 相似度評價

將12批浮小麥指紋圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”中，以S1為參照圖譜進行相似度評價，結(jié)果見表3。12批不同產(chǎn)地浮小麥指紋圖譜相似度為0.936～0.996，均大于0.9，整體相似度較高，表明浮小麥性質(zhì)較為穩(wěn)定。

表3 不同產(chǎn)地浮小麥HPLC指紋圖譜的相似度

2.4 聚類分析

將12批樣品共有峰的相對峰面積作為原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用平方歐式距離為樣品間距離計算方法，對數(shù)據(jù)進行標準化轉(zhuǎn)換，進行聚類分析，見圖4。根據(jù)藥材聚類分析結(jié)果，12批不同產(chǎn)地浮小麥可以被聚為3類，第1類: S8號樣品；第2類: S1、S4、S10號樣品；第3類: S2、S3、S5、S6、S7、S9、S11、S12號樣品。表明生產(chǎn)產(chǎn)地相同或地理位置相似的樣品被聚在一起，與相似度分析結(jié)果基本一致。

圖4 不同產(chǎn)地浮小麥聚類分析

2.5 主成分分析

為了進一步探討不同產(chǎn)地的浮小麥成分之間的差異性，在相似度和聚類分析的基礎(chǔ)上，對指紋圖譜所得到的16個共有峰的峰面積進行標準化處理，以標準化后的共有峰峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進行主成分分析，結(jié)果見表4。選取前4個特征值>1的成分為主成分對浮小麥指紋圖譜進行描述，其累計方差貢獻率為86.621%，能夠較好地反映其化學(xué)成分特征。對主成分載荷值進行計算，得出主成分線性模型。并根據(jù)公式F=(0.33.642F1+0.272 64F2+0.179 75F3+0.077 40F4)/86.622(F代表主成分綜合得分，F(xiàn)1、F2、F3、F4分別代表4個主成分得分)計算綜合得分，見表5、表6。不同產(chǎn)地浮小麥綜合得分為-5.78～5.76，若以16個共有成分為綜合評價指標，其中山東、河南、山西浮小麥總體評分較高。主成分分析能把不同產(chǎn)地浮小麥分開，說明其質(zhì)量存在差異。

表4 主成分特征值及累計方差貢獻率

表5 主成分矩陣

表6 不同產(chǎn)地浮小麥主成分得分和綜合得分

3 結(jié)論

從兼顧各個色譜峰的分離度、基線平穩(wěn)度和色譜峰信息完全度出發(fā)，使用島津HPLC二極管陣列檢測器，考察了多個波長和4種不同體系的流動相，最終確定儀器檢測條件：以乙腈-0.1%磷酸水做流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，在203 nm處進行指紋圖譜掃描。對12種不同產(chǎn)地浮小麥建立了指紋圖譜，其相似度為0.936～0.996，均大于0.9，可以表征浮小麥的特征屬性。通過CA和PCA分析12批樣品可聚為三類，其中山東、河南、山西產(chǎn)地浮小麥質(zhì)量評價分數(shù)較高，其他地區(qū)浮小麥質(zhì)量評價分數(shù)存在一定差異性，這可能與浮小麥生長環(huán)境、儲存條件等因素有關(guān)。該指紋圖譜的建立為浮小麥質(zhì)量評價和合理應(yīng)用提供了依據(jù)。