基于線粒體DNA Cyt b西伯利亞狍種群分子系統(tǒng)地理學(xué)研究

梁 雪 周紹春 劉艷華*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.黑龍江省野生動(dòng)物研究所，哈爾濱，150081)

鹿科(Cervidae)動(dòng)物廣泛分布于整個(gè)歐亞大陸，包括40種鹿[1]。狍(Capreolus)是鹿科中分布最廣泛的哺乳動(dòng)物之一，其中包括體形較小的歐洲狍(Capreoluscapreolus)和體形較大的西伯利亞狍(Capreoluspygargus)。這兩種狍的區(qū)別主要表現(xiàn)在形態(tài)和基因上的差異。西伯利亞狍分布范圍從伏爾加河右岸延伸到俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，包括哈薩克斯坦、天山、阿拉泰、蒙古、中國(guó)的華北和華中地區(qū)。盡管對(duì)亞種的分類仍有爭(zhēng)議，但學(xué)者普遍認(rèn)為西伯利亞狍至少由3個(gè)亞種組成，即C.pygarguspygargus(從伏爾加河到貝加爾湖和俄羅斯東北部)、C.pygargustianschanicus(或C.c.bedfordi)(天山、蒙古、俄羅斯遠(yuǎn)東和韓國(guó))和C.pygargusmelanotis(西藏東部、甘肅、四川、中國(guó))。

與歐洲狍相比西伯利亞狍在分子系統(tǒng)地理學(xué)上的研究較少。Randi等[2]的研究認(rèn)為，西伯利亞狍可分為兩大集群，即俄羅斯遠(yuǎn)東阿穆爾地區(qū)的東部集群和西伯利亞西部庫(kù)爾干地區(qū)的西部集群?；赗APD標(biāo)記(random amlified polymorhic DNA)，Petrosyan等[3]的研究結(jié)果證實(shí)了將西部和東部群體分別劃分為C.pygarguspygargus和C.pygargustianschanicus的科學(xué)性。另一方面，根據(jù)與其他亞種的形態(tài)差異，Xiao等[4]的研究認(rèn)為在中國(guó)東北發(fā)現(xiàn)的西伯利亞狍屬于C.pygargusmanchuricus亞種。Lorenzini等[5]的系統(tǒng)發(fā)育分析研究結(jié)果表明西伯利亞狍的3個(gè)單倍群分布在該物種整個(gè)分布范圍內(nèi)，即俄羅斯西部和東部、吉爾吉斯斯坦、中國(guó)東北和華北，但沒有明顯的地理結(jié)構(gòu)。此外，部分學(xué)者[6-7]的研究還發(fā)現(xiàn)韓國(guó)濟(jì)州島的狍與其他種群存在遺傳差異，并將韓國(guó)濟(jì)州島分布的孤立種群命名為第四亞種C.pygargusochracea。

系統(tǒng)地理學(xué)以系統(tǒng)發(fā)育及地理分布結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)開展研究，且將以線粒體基因?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育等方法應(yīng)用于各個(gè)生物類群研究。線粒體DNA是一種共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，具有遵循母系遺傳、進(jìn)化速率快、遺傳上相對(duì)獨(dú)立、無組織特異性等優(yōu)點(diǎn)，在物種系統(tǒng)發(fā)育，種內(nèi)遺傳分化等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[8-9]。最常用的線粒體DNA標(biāo)記基因是Cytb基因，因?yàn)镃ytb是線粒體基因中結(jié)構(gòu)和功能最為清楚的基因之一[10]，該基因進(jìn)化速度適中，對(duì)種群間、種間、屬間甚至科間的系統(tǒng)發(fā)育研究均適用[11]。因此本研究以Cytb基因?yàn)闃?biāo)記方式，對(duì)西伯利亞狍分子系統(tǒng)地理學(xué)進(jìn)行探索性研究以期為西伯利亞狍的分子系統(tǒng)地理學(xué)研究補(bǔ)充數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和DNA擴(kuò)增

本研究樣品采自小興安嶺地區(qū)，通過足跡跟蹤收集新鮮狍糞便40份。樣品采集時(shí)，將每份樣品進(jìn)行封裝，封裝后的樣品低溫保存，直至運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室放進(jìn)-20 ℃以下冰箱內(nèi)。

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便DNA，采用引物L(fēng)14724[12]：5′ CGA GAT CTGAAAAAC CAT CGT TG 3′ 和H15149[13]：5′ AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3′擴(kuò)增Cytb序列。PCR反應(yīng)體系為：2 μLDNA、6 μL dNTPs、0.9 μLF引物、0.9 μLR引物、0.6 μLTaqTMDNA聚合酶、15 μL 1 × PCR buffer、4.6 μL H2O。PCR反應(yīng)體系在94 ℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)入如下循環(huán)：98 ℃ 變性10 s，59 ℃退火30 s，68℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后68 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物采用 1.0%的常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量為 5 μL PCR 產(chǎn)物加1 μL 6×loading buffer，120V 電壓電泳 30 min，Good wall 染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳譜帶，并將電泳條帶較亮較窄的擴(kuò)增產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物科技有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。

1.2 數(shù)據(jù)分析

將所測(cè)的序列結(jié)果應(yīng)用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行DNA序列排列，并輔以人工校對(duì)[14]。通過BLAST搜索[15]，與已知的西伯利亞狍線粒體同源序列比對(duì)，確定是否為目的序列。應(yīng)用DnaSP 4.0軟件[16]確定單倍型。應(yīng)用MEGA 7軟件[17]，采用最大似然法、鄰接法和最大簡(jiǎn)約法進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自引導(dǎo)檢驗(yàn)(bootstrap)獲得系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1 000)。應(yīng)用PopART 1.7軟件[18]，基于TCS Network分析單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果

從獲得的40份糞便樣品中成功擴(kuò)增出32個(gè)序列，序列長(zhǎng)度為403 bp，獲得9個(gè)單倍型，單倍型多樣性(h)為(0.813±0.045)，核苷酸多樣性(Pi)為(0.004 74±0.000 71)，平均核苷酸變異數(shù)(K)為1.911。從GenBank上下載40條序列(表1)，獲得23個(gè)單倍型。以馬鹿(Cervuselaphus)(登錄號(hào)：GU457434)為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。3種不同的系統(tǒng)發(fā)育樹具有基本相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，最清晰全面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是由鄰接法生成的(圖1)。

圖1 基于NJ法構(gòu)建的西伯利亞狍mtDNA Cyt b基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，以馬鹿為同源序列的外群，節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字為Bootstrap重復(fù)百分比，重復(fù)次數(shù)為1 000Fig.1 Phylogenetic tree of mtDNA Cyt b gene of Capreolus pygargus constructed based on NJ method.Red deer(Cervus elaphus)was the outgroup of homologous sequence.The number at the node is the percentage of bootstrap repeats with 1 000 repetitions

表1 GenBank下載序列信息Tab.1 GenBank download sequence information

系統(tǒng)發(fā)育樹主要由4個(gè)單倍群組成，分別命名為A、B、C、D。其中A由俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)(Khabarovsk、Yakutia)和韓國(guó)濟(jì)州島的單倍型組成。B由哈薩克斯坦、俄羅斯西伯利亞地區(qū)(Sverdlovsk、Irkutsk)和波蘭等地區(qū)的單倍型組成。C由中國(guó)東北地區(qū)的單倍型組成。D由蒙古地區(qū)的單倍型組成。A和B與C、D是并行的姐妹枝。A、B、C基本符合西伯利亞狍亞種分類：C.pygarguspygargus、C.pygargustianschanicus(或C.c.bedfordi)和C.pygargusmelanotis。由西伯利亞狍的單倍型網(wǎng)絡(luò)分析圖(圖2)可以看出，西伯利亞狍明顯由四簇單倍群組成，其結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹一致。

圖2 基于TCS Network構(gòu)建的西伯利亞狍mtDNA Cyt b基因單倍型網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 Haplotype Network analysis of mtDNA Cyt b gene of Capreolus pygargus constructed based on TCS Network

3 討論

本研究分析了中國(guó)小興安嶺地區(qū)40份野生西伯利亞狍樣品的線粒體DNA Cytb基因的部分序列，并與GenBank 中其他地區(qū)西伯利亞狍的序列進(jìn)行分析研究，系統(tǒng)發(fā)育分析與單倍型網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明西伯利亞狍由4個(gè)單倍群組成，有較清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和地理模式，這與其他學(xué)者研究結(jié)果相吻合。部分學(xué)者[2，19-20]使用mtDNA序列的研究結(jié)果表明西伯利亞狍可以分為兩個(gè)具有地理模式的主要集群，即西伯利亞東部集群和西伯利亞西部集群，且符合西伯利亞狍亞種C.pygarguspygargus和C.pygargustianschanicus的分布范圍。另外，Lee[21]使用微衛(wèi)星標(biāo)記的研究結(jié)果表明，基于Nei’s DA距離建立的UPGMA樹具有3簇拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，韓國(guó)大陸、蒙古、西伯利亞東部的種群聚為一枝，西伯利亞中部的種群聚為一枝，韓國(guó)濟(jì)州島的種群?jiǎn)为?dú)聚為一枝。

相反，在部分學(xué)者的系統(tǒng)地理學(xué)研究中認(rèn)為西伯利亞狍沒有明顯的地理模式[5，22-23]。Lorenzini等[5]通過貝葉斯分析獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹包括3個(gè)主要單倍群：?jiǎn)伪度篈由俄羅斯西部、吉爾吉斯斯坦、波蘭、立陶宛和中國(guó)華北等地區(qū)的單倍型組成；單倍群B由俄羅斯東部和中國(guó)東北地區(qū)的單倍型組成；單倍群C由俄羅斯東部、中國(guó)東北和華北地區(qū)的單倍型組成，遺傳譜系和地理分布之間無法建立任何關(guān)系。實(shí)際上，在西伯利亞、吉爾吉斯坦和俄羅斯遠(yuǎn)東人口稀少的地區(qū)，沒有任何自然或人為的屏障來阻止不同種群的西伯利亞狍的混合。Vorobieva等[23]的研究表明，在西伯利亞狍亞種的假定分布范圍內(nèi)，沒有發(fā)現(xiàn)任何與亞種分布范圍一致的單倍群。

在系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)單倍群B包含假定于歐洲狍分布范圍內(nèi)的單倍型，即波蘭地區(qū)的單倍型。目前，在伏爾加河和唐河之間的區(qū)域被認(rèn)為是歐洲狍和西伯利亞狍的雜交區(qū)域。這兩個(gè)物種的大部分進(jìn)化史可能都生活在不同區(qū)域中。在史前時(shí)期，由于它們重疊區(qū)域的交替收縮和擴(kuò)張，兩個(gè)物種種群的混合肯定不止一次[24]。因此可能是由于種群擴(kuò)張過程中高度分化譜系之間的雜交而引起的一個(gè)古老基因的滲入[5]。此外，韓國(guó)濟(jì)州島和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的單倍型組成單倍群A，但在其他學(xué)者的研究中，韓國(guó)濟(jì)州島的西伯利亞狍為一個(gè)孤立種群，與其他所有的西伯利亞狍(包括韓國(guó)大陸的種群)在基因上存在分歧[21]。有學(xué)者對(duì)韓國(guó)濟(jì)州島的西伯利亞狍提出了第四亞種命名C.p.ochracea[7]。由于本研究?jī)H采用mtDNA一種遺傳標(biāo)記方式，具有其母系遺傳的局限性，對(duì)于韓國(guó)濟(jì)州島的西伯利亞狍還需基于更多的遺傳標(biāo)記方式開展進(jìn)一步的研究。

本研究表明，至少有4個(gè)不同的遺傳譜系可能存在于西伯利亞狍的種群：俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)和韓國(guó)濟(jì)州島，俄羅斯西伯利亞地區(qū)、哈薩克斯坦和波蘭，中國(guó)，蒙古。諸如西伯利亞狍之類的食草動(dòng)物在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，為大型食肉動(dòng)物提供了獵物。因此對(duì)西伯利亞狍種群進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪z傳管理，開展遺傳狀況持續(xù)監(jiān)測(cè)研究，這對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)健康發(fā)展至關(guān)重要。