抗白粉病基因 PmCH1357相關(guān)分子標(biāo)記驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

陳 芳，李 欣，喬麟軼，李 銳，郭慧娟，常利芳，張樹偉，閻曉濤，暢志堅(jiān),3，張曉軍,3，李東方

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030031； 3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030031； 4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠 831300)

由活體營(yíng)養(yǎng)型真菌Blumeriagraminisf. sp.tritici(Bgt)引起的白粉病是小麥的一種主要病害，可嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。培育并種植適應(yīng)當(dāng)?shù)氐目共⌒←溒贩N是控制該病害最為有效、經(jīng)濟(jì)并對(duì)環(huán)境安全的措施[2]。然而，小麥白粉菌生理小種多，毒性基因變異快，多數(shù)推廣的抗病品種廣泛種植3～5年后便開始喪失抗性[3-4]。因此，亟需持續(xù)挖掘和定位新的抗白粉病基因，開發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過分子標(biāo)記輔助選擇，加速小麥抗病育種進(jìn)程。

分子標(biāo)記輔助選擇是利用分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖或共分離的特點(diǎn)，通過檢測(cè)分子標(biāo)記的基因型來跟蹤目標(biāo)基因的存在，不受環(huán)境影響，可快速、準(zhǔn)確地對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇[5-6]。目前，借助分子標(biāo)記輔助選擇已將多個(gè)白粉病抗性基因轉(zhuǎn)育到生產(chǎn)品種中。Xu等[7]通過與Pm2b緊密連鎖的標(biāo)記Xbwm20、Xbwm21、Xbwm25和Xcfd81構(gòu)建了含Pm2b基因的以推廣品種石麥15、石新828和科農(nóng)199為遺傳背景的近等基因系；劉金元等[8]借助與Pm2及Pm4a緊密連鎖的標(biāo)記對(duì)小麥品種或品系進(jìn)行輔助選擇，成功獲得了含有3個(gè)白粉病抗性基因組合“Pm2+Pm4a”、“Pm2+Pm21”和“Pm4a+Pm21”的優(yōu)異小麥品種揚(yáng)麥158；桑大軍等[9]通過回交育種與分子標(biāo)記相結(jié)合將抗白粉病基因Pm13、Pm21、Pm30和Pm33導(dǎo)入小麥品種鄭麥9023中，獲得了抗白粉病的鄭麥9023近等基因系，并通過雜交育種與分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，育成了含白粉病抗性基因的新品種鄭麥835、鄭麥863和鄭麥883。

白粉病抗病性鑒定通常采用人工接種法進(jìn)行，但其發(fā)病情況易受環(huán)境等因素影響，嚴(yán)重降低了選擇效率。育種過程中通過分子標(biāo)記能高效地對(duì)該目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，而分子標(biāo)記輔助選擇的關(guān)鍵是有穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記。目前雖已開發(fā)出大量與白粉病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，但這些標(biāo)記多被應(yīng)用于抗病基因的定位或克隆中，它們?cè)诓煌z傳背景下的有效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，分子標(biāo)記的有效性評(píng)價(jià)越來越受到育種家的關(guān)注。張維軍等[10]利用5個(gè)小麥穗發(fā)芽功能性KASP標(biāo)記對(duì)185份寧夏小麥種質(zhì)資源進(jìn)行穗發(fā)芽抗性篩選，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Phs646和Phs666是穗發(fā)芽抗性鑒定的有效標(biāo)記，而標(biāo)記Vp1B1-83只能作為參考標(biāo)記；胡洋山等[11]通過小麥分蘗成穗數(shù)基因相關(guān)分子標(biāo)記與單位面積最大分蘗數(shù)和單位面積穗數(shù)的相關(guān)性研究，篩選到2個(gè)實(shí)用性的分子標(biāo)記。但是關(guān)于白粉病抗性基因相關(guān)分子標(biāo)記有效性評(píng)價(jià)方面的報(bào)道較少。本課題前期通過臺(tái)長(zhǎng)29/CH1357的F2群體在小偃麥衍生品系CH1357中定位到一個(gè)顯性抗白粉病基因PmCH1357，其連鎖標(biāo)記為Xgwm190-22.2-Xbwm9-1.5-Xbwm8-11.3-PmCH1357-2.0-Xcfd81-0.8-Xbwm20-0.3-Xbwm21-0.7-Xbwm25-1.7-Xmp510。鑒于此，本研究利用前期定位的8個(gè)相關(guān)分子標(biāo)記對(duì)以感白粉病品種晉麥66和抗白粉病品系CH1357構(gòu)建的341個(gè)F2:3家系進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證并評(píng)估這8個(gè)相關(guān)分子標(biāo)記在該群體中的有效性及實(shí)用性，以期為小麥抗病育種的分子標(biāo)記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與白粉病菌株

白粉病苗期抗病性鑒定材料包括抗病親本CH1357(中8701//冀麥26/小偃7430)、感病品種晉麥66(原名太原610，由土耳其材料62166為母本，太原251為父本雜交選育而成)[12]及由二者構(gòu)建的341個(gè)F2:3家系。

苗期白粉病抗性鑒定所用菌株E09由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周益林研究員惠贈(zèng)，本課題組通過活體幼苗保存。該菌株是在中國(guó)中部和北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)廣譜型白粉菌株，對(duì)Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm5e、Pm12、Pm16、Pm21和Pm30等抗白粉病基因表現(xiàn)為無毒，而對(duì)Pm1、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm5a、Pm17和Pm19等抗白粉病基因表現(xiàn)為有毒[13]。

1.2 苗期白粉病抗性鑒定

在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工培養(yǎng)氣候室中對(duì)供試材料進(jìn)行苗期白粉病抗性鑒定。用75%的無水乙醇對(duì)每個(gè)株系的種子浸泡消毒后種植于72穴的育苗盤，每穴5粒種子，每個(gè)育苗盤種植8穴對(duì)照品種臺(tái)長(zhǎng)29作為誘發(fā)穴，以確保病害的充分發(fā)生。人工氣候室條件為光照強(qiáng)度125 μmol·m-2·s-1，光周期12 h，溫度16～22 ℃(光照時(shí)22 ℃，無光照時(shí)16 ℃)，濕度70%左右。種植大約10 d后，用預(yù)先繁殖的新鮮白粉菌人工掃抹幼苗，每株系處理10株苗，重復(fù)鑒定3次。接菌大約10 d后，待感病對(duì)照晉麥66充分發(fā)病后，用 0～4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]逐一調(diào)查每個(gè)株系的反應(yīng)類型。其中0級(jí)為免疫型，0；級(jí)為近免疫型，1級(jí)為高抗型，2級(jí)為中抗型，3級(jí)為中感型，4級(jí)為高 感型。

1.3 抗白粉病基因標(biāo)記

試驗(yàn)選用本課題組前期在(臺(tái)長(zhǎng)29/CH1357)F2群體中定位的8個(gè)與白粉病抗性基因PmCH1357相關(guān)的分子標(biāo)記，驗(yàn)證并評(píng)價(jià)其在不同遺傳背景中的有效性，引物信息詳見表1。

表1 8對(duì)與抗白粉病基因 PmCH1357連鎖的標(biāo)記及引物序列Table 1 Eight markers linked to the powdery mildew resistance gene PmCH1357 and primers applied in this study

1.4 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

在三葉期剪取親本及341個(gè)F2:3家系植株的幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，用CTAB法[18]提取基因組DNA，用NANODROP 2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為10 μL，含1.0 μL DNA模板(50 ng·μL-1)、1.0 μL 10×buffer(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol·L-1KCl，1.5 mmol·L-1MgCl2)，0.25 μL dNTP (0.2 mmol·L-1)、0.4 μL引物(10 μmol·L-1)、0.2 μL Taq酶和7.15 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55～62 ℃(依引物退火溫度而定)復(fù)性45 s，72 ℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr與Bis質(zhì)量比為29∶1)電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，硝酸銀染后，甲醛溶液中顯色照相并統(tǒng)計(jì)標(biāo)記基因型帶型。

2 結(jié)果與分析

2.1 8對(duì)抗白粉病基因(PmCH1357)相關(guān)標(biāo)記的基因型檢測(cè)結(jié)果

利用(臺(tái)長(zhǎng)29/CH1357)群體中定位的抗白粉病基因PmCH1357的8對(duì)相關(guān)標(biāo)記對(duì)晉麥66/CH1357的341個(gè)F2:3單株進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果(表2)表明，8對(duì)相關(guān)標(biāo)記中只有標(biāo)記Xmp510為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合抗病基因型和雜合抗病基因型，其余7對(duì)標(biāo)記均為共顯性標(biāo)記，能清晰地區(qū)分純合抗病基因型和雜合抗病基因型。部分標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。

表2 8對(duì)抗白粉病基因( PmCH1357)連鎖標(biāo)記在(晉麥66/CH1357)F2:3家系中的擴(kuò)增帶型分布Table 2 PCR amplification patterns of the eight markers associated with powdery mildew resistance gene PmCH1357 in the population of(Jinmai 66/CH1357) F2:3 lines

2.2 單個(gè)連鎖標(biāo)記選擇的有效性

利用白粉病菌株E09對(duì)上述標(biāo)記檢測(cè)為純合抗病基因型的單株進(jìn)行苗期白粉病抗性鑒定。結(jié)果表明(表3)，標(biāo)記Xcfd81檢測(cè)的63個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為62個(gè)，基因型與表型符合率為98.4%；標(biāo)記Xbwm21檢測(cè)的66個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為63個(gè)，基因型與表型符合率為95.5%；標(biāo)記Xbwm20檢測(cè)的65個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為62個(gè)，基因型與表型符合率為95.4%；標(biāo)記Xbwm25檢測(cè)的65個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為61個(gè)，基因型與表型符合率為 93.8%；標(biāo)記Xbwm8檢測(cè)的63個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為54個(gè)，基因型與表型符合率為85.7%；標(biāo)記Xbwm9檢測(cè)的63個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為54個(gè)，基因型與表型符合率為85.7%；標(biāo)記Xgwm190檢測(cè)的77個(gè)純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為41個(gè)，基因型與表型符合率為53.2%；標(biāo)記Xmp510檢測(cè)的267個(gè)抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為69個(gè)，基因型與麥型符合率為25.8%。

2.3 標(biāo)記組合在分子標(biāo)記輔助選擇中的有效性

將不同標(biāo)記兩兩組合，進(jìn)一步分析其在分子標(biāo)記輔助選擇中的有效性，結(jié)果見表3。從基因型與表型符合率來看，單獨(dú)用Xcfd81對(duì)PmCH1357進(jìn)行選擇時(shí)，基因型與表型符合率為98.4%；用標(biāo)記組合Xcfd81+Xbwm8、Xcfd81+Xbwm9或Xcfd81+Xgwm190進(jìn)行選擇時(shí)，基因型與表型符合率均可達(dá)到100%；但用標(biāo)記組合Xcfd81+Xbwm21、Xcfd81+Xbwm20和Xcfd81+Xbwm25進(jìn)行選擇時(shí)，基因型與表型的符合率為98.4%，與單獨(dú)使用Xcfd81的結(jié)果相同。單獨(dú)使用Xbwm21、Xbwm20或Xbwm25對(duì)PmCH1357進(jìn)行選擇時(shí)，基因型與表型的符合率分別為95.5%、95.4%和93.8%；當(dāng)它們分別與Xbwm8、Xbwm9或Xgwm190組合使用時(shí)，基因型與表型的符合率均達(dá)到97%以上，甚至100%；但Xcfd81、Xbwm21、Xbwm20和Xbwm25兩兩組合使用時(shí)，基因型與表型的符合率與該2個(gè)標(biāo)記中遺傳距離較近的標(biāo)記相比無明顯差異。Xgwm190、Xbwm9和Xbwm8兩兩組合使用時(shí)，基因型與表型的符合率與該2個(gè)標(biāo)記中遺傳距離較近的標(biāo)記相比無明顯差異。表明使用基因兩側(cè)的標(biāo)記進(jìn)行篩選可獲得更高的選擇準(zhǔn)確率。

Pr：抗病親本CH1357；Ps：感病親本晉麥66；1～22：F2:3群體株系編號(hào)。

從獲得的純合抗病表型株系數(shù)量來看，單獨(dú)使用1個(gè)標(biāo)記進(jìn)行選擇時(shí)，除Xmp510為顯性標(biāo)記，無法準(zhǔn)確區(qū)分純合抗病與雜合抗病基因型外，遺傳距離較近的標(biāo)記可以獲得較多的抗病株系，而遺傳距離較遠(yuǎn)的標(biāo)記獲得的抗病株系則較少，表明連鎖標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離是影響選擇效率的一個(gè)重要因素。從表3可以看出，當(dāng)使用2個(gè)標(biāo)記組合進(jìn)行選擇時(shí)，篩選出的純合抗病株系數(shù)量與遺傳距離較遠(yuǎn)的標(biāo)記篩選的株系數(shù)量相比沒有明顯差異，甚至有所減少。如在PmCH1357的下游，Xbwm25的遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)使用Xbwm25篩選獲得的純合抗病株系數(shù)量為61個(gè)，而使用Xcfd81+Xbwm25、Xbwm21+Xbwm25和Xbwm20+Xbwm25標(biāo)記組合篩選獲得的純合抗病株系數(shù)量則分別是60、61和61個(gè)，與單獨(dú)使用Xbwm25篩選結(jié)果無明顯差異。Xbwm8、Xbwm9或Xgwm190都位于PmCH1357的上游，且與PmCH1357遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，分別為11.3、12.8和35.0 cM，單獨(dú)使用1個(gè)標(biāo)記篩選獲得的純合抗病株系數(shù)量分別為54、54和41個(gè)，而使用下游遺傳距離最近的標(biāo)記Xcfd81與這3個(gè)標(biāo)記組合篩選時(shí)，獲得的純合抗病株系數(shù)量分別為53、52和38個(gè)，與單獨(dú)使用這3個(gè)標(biāo)記相比無明顯差異。這表明，在使用2個(gè)標(biāo)記組合篩選時(shí)，獲得的純合抗病株系數(shù)量受到遺傳距離較遠(yuǎn)的標(biāo)記限制。

表3 8個(gè)連鎖標(biāo)記及不同標(biāo)記組合的符合率評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of the selection efficiency with eight markers and their combinations associated with powdery mildew resistance gene PmCH1357

3 討 論

將多個(gè)不同的抗病基因聚合到同一優(yōu)良品種或品系中可有效提高品種抗性及抗病持久性[19]，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為小麥抗病基因的聚合提供了有利條件。目前，小麥中與各種性狀相關(guān)的分子標(biāo)記已有大量報(bào)道，但這些分子標(biāo)記大多用于基因的染色體定位，而基因定位是基于特定親本構(gòu)建的遺傳群體進(jìn)行的，因此，與該基因連鎖的分子標(biāo)記大多僅在特定的環(huán)境或遺傳背景中能有效追蹤目標(biāo)基因的存在，實(shí)際應(yīng)用中分子標(biāo)記的使用缺乏一定的通用性。例如楊 燕等[20]和張兆萍等[21]分別利用4個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的分子標(biāo)記Vp1B3、MST101、Xgwm155和wmc104對(duì)不同品種進(jìn)行了檢測(cè)，楊 燕等[20]認(rèn)為，MST101和wmc104與穗發(fā)芽抗性不相關(guān)，Vp1B3和Xgwm155與穗發(fā)芽抗性相關(guān)；而張兆萍等[21]則認(rèn)為，Xgwm155、MST101與穗發(fā)芽抗性不相關(guān)，Vp1B3和wmc104與穗發(fā)芽抗性相關(guān)；僅Vp1B3在中國(guó)品種中表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的選擇效率。因此，對(duì)現(xiàn)有分子標(biāo)記在不同遺傳背景或品種中的有效性驗(yàn)證具有十分重要的意義。

本研究對(duì)前期在小偃麥衍生品系CH1357中定位的位于染色體5DS上的抗白粉病基因PmCH1357相關(guān)的8對(duì)分子標(biāo)記通過晉麥66/CH1357 F2:3家系群體進(jìn)行了有效性評(píng)價(jià)。4對(duì)分子標(biāo)記Xcfd81、Xbwm21、Xbwm20和Xbwm25對(duì)整個(gè)群體檢測(cè)的純合抗病基因型與純合表現(xiàn)型符合率均達(dá)到93%以上，可用于抗白粉病基因PmCH1357的篩選；標(biāo)記Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190對(duì)群體檢測(cè)的純合抗病基因型和純合表現(xiàn)型符合率偏低，原因可能是分子標(biāo)記與目標(biāo)基因間的遺傳距離影響分子標(biāo)記輔助選擇效率[22]，分子標(biāo)記與目標(biāo)基因連鎖越緊密，二者間發(fā)生交換重組的概率越低，選擇效率則越高。Peng等[23]認(rèn)為，分子標(biāo)記與目標(biāo)基因間的遺傳距離小于2.0 cM時(shí)，標(biāo)記檢測(cè)的準(zhǔn)確率及有效性可達(dá)到90%以上。三個(gè)標(biāo)記Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190距離目標(biāo)基因較遠(yuǎn)，遺傳距離分別為11.3 cM、12.8 cM和35.0 cM，標(biāo)記與目標(biāo)基因間發(fā)生重組的可能性較大，故選擇效率較低；標(biāo)記Xmp510與目標(biāo)基因的遺傳距離為5.5 cM，選擇效率卻僅有25.8%，可能因?yàn)樵摌?biāo)記為顯性標(biāo)記，不能有效區(qū)分純合和雜合抗病基因型，在育種實(shí)踐中存在較大的局限性。

分子標(biāo)記輔助選擇中通過多對(duì)標(biāo)記的結(jié)合使用，可提高選擇效率和準(zhǔn)確性[24-25]。本研究通過對(duì)不同標(biāo)記組合的選擇效率進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組合標(biāo)記位于連鎖基因的同一側(cè)時(shí)，表型和基因型的符合率并無明顯增加，純合抗病株系數(shù)量卻有所降低，其原因可能是當(dāng)標(biāo)記位于基因同一側(cè)時(shí)，同一個(gè)重組株系會(huì)在不同標(biāo)記間表現(xiàn)出不同的基因型，遺傳距離近的標(biāo)記受到遺傳距離遠(yuǎn)的標(biāo)記限制，遺失更多的純合抗病株系，從而降低了標(biāo)記的選擇效率；但當(dāng)2個(gè)組合標(biāo)記分別位于基因兩側(cè)時(shí)，表型和基因型的符合率顯著提高，不同側(cè)標(biāo)記組合進(jìn)行選擇后表型和基因型的符合率基本相同，而獲得的純合抗病株系數(shù)受到遺傳距離較遠(yuǎn)的標(biāo)記的限制。因此，在使用連鎖標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇的時(shí)候，選擇基因兩側(cè)的標(biāo)記進(jìn)行組合可獲得較好的選擇效果；為了進(jìn)一步提高選擇效率，避免遺失更多的有效株系，應(yīng)盡量選擇與該基因遺傳距離較近的標(biāo)記。所以，在對(duì)抗白粉病基因PmCH1357進(jìn)行選擇時(shí)，使用標(biāo)記組合Xcfd81+Xbwm8進(jìn)行篩選可以獲得更高的準(zhǔn)確性及更多的有效株系。

總之，現(xiàn)有的分子標(biāo)記多數(shù)為連鎖標(biāo)記，擴(kuò)增帶型反映的是特定基因組區(qū)段的序列特征，并不代表目標(biāo)基因本身。因此，為了有效提高分子標(biāo)記選擇的準(zhǔn)確性，還需對(duì)抗病基因PmCH1357構(gòu)建高密度的飽和遺傳圖譜，尋找與該抗病基因更為緊密的兩側(cè)標(biāo)記，或克隆該基因，開發(fā)可直接用于抗病基因選擇的功能標(biāo)記或共分離標(biāo)記，以進(jìn)一步提高分子標(biāo)記選擇的效率。