CRISPR/Cas9技術(shù)及其在胰腺癌研究中的應(yīng)用進(jìn)展

莊云英，張海燕 綜述 曾清芳 審校

胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤中惡性程度較高的一種，具有較高的病死率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年美國(guó)有56 770例胰腺癌新病例和45 750例胰腺相關(guān)死亡病例，與其他常見(jiàn)的癌癥相比，胰腺癌的患者預(yù)后一直未得到明顯改善，5年相對(duì)生存率僅為9%[1]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外各個(gè)科研團(tuán)隊(duì)在探究胰腺癌更好的治療策略方面已經(jīng)付出了相當(dāng)大的努力，如靶向治療、免疫治療和潛在的規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) 相關(guān)蛋白9(RISPR/Cas9)定向基因治療等，但手術(shù)、放療和化療仍然是當(dāng)前臨床上胰腺癌的主要治療方法。

目前，RISPR/Cas9已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的基因編輯工具，并在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域具有潛力。CRISPR重復(fù)序列最早由Ishino等[2]在1987年發(fā)現(xiàn)，隨后在2012年，Jinek等[3]的研究證明了一個(gè)內(nèi)切酶可以被一個(gè)雙RNA結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)直接切割目標(biāo)DNA。從那時(shí)起，CRISPR/Cas9技術(shù)迅速發(fā)展，并促進(jìn)基礎(chǔ)和臨床研究取得了驚人的進(jìn)展。與其他基因編輯技術(shù)相比，如巨核酸酶 (meganucleases，MNs)、鋅指核酸酶 (zinc finger nucleases，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，CRISPR/Cas9技術(shù)成本更低、效率更高、應(yīng)用更簡(jiǎn)單[4]。由于近年來(lái)CRISPR/Cas9技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，筆者就CRISPR/Cas9及其在胰腺癌中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)

有規(guī)則間隔的短回文重復(fù)聚類(lèi) (CRISPR)是Ishino等[2]在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一段高度保守的核苷酸序列，它位于同工酶轉(zhuǎn)化堿性磷酸酶基因3’末端的側(cè)邊區(qū)域，表現(xiàn)為14 bp的二元對(duì)稱(chēng)。然而，直到2007年Barrangou等[5]將嗜熱鏈球菌暴露于噬菌體中并對(duì)由此產(chǎn)生的抗噬菌體變體進(jìn)行測(cè)序，人們才充分認(rèn)識(shí)到CRISPR序列的功能和生物學(xué)重要性。對(duì)變異DNA的分析表明，這種細(xì)菌從噬菌體基因組中獲得了的新的CRISPR間隔。隨后，對(duì)細(xì)菌基因組中CRISPR序列的識(shí)別引出了一組稱(chēng)為CRISPR的同源基因和相關(guān)(Cas)基因的識(shí)別，它們共同組成了CRISPR位點(diǎn)。受到病毒感染插入CRISPR-Cas的細(xì)菌基因組表明，CRISPR-Cas可能提供對(duì)噬菌體的抗性，并能通過(guò)插入或刪除間隔噬菌體序列，使感染的抗性增強(qiáng)或減弱。

Jinek等[3]在2012年首次證明了CRISPR- Cas系統(tǒng)可以產(chǎn)生成熟的CRISPR RNA (crRNA)和堿基對(duì)反式激活crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)，共同形成雙RNA雜交結(jié)構(gòu)。這種雙RNA結(jié)構(gòu)能夠?qū)RISPR相關(guān)蛋白Cas9引致特異性DNA序列，并在目標(biāo)DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂[2]。2013年，Cong等[6]及Mali等[7]分別利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯了人EMX1、PVALB、PPP1R12C基因和小鼠Th基因的DNA序列。這是首次展示了CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯真核細(xì)胞基因組的能力。此后，大量的研究提高了基因編輯工具CRISPR/Cas9在不同物種中的特異性、正交性和多樣性，并促進(jìn)了其在生物組學(xué)中的應(yīng)用和發(fā)展。

CRISPR/Cas9技術(shù)在動(dòng)物模型的生成、基因功能研究、多路復(fù)用突變和染色體重排等方面得到了快速的推廣和應(yīng)用。與MNs、ZFNs、TALENs等傳統(tǒng)編輯工具相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有成本更低、效率更高、更加簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。

2 在胰腺癌研究中的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 胰腺癌中CRISPR/Cas9的基因編輯 同源引導(dǎo)RNA可以引導(dǎo)Cas9核酸酶靶向基因組中的特定位點(diǎn)。當(dāng)Cas9被引導(dǎo)到目標(biāo)DNA序列，并且下游有一個(gè)前間隔序列相鄰模體(protospacer adjacent motif，PAM)序列時(shí)，它將在該位置切斷基因組的兩條鏈。然后，細(xì)胞利用兩種不同的機(jī)制修復(fù)斷裂：(1)利用非同源末端連接修復(fù)途徑進(jìn)行不精確地修復(fù)，這會(huì)導(dǎo)致堿基的插入或刪除；(2)通過(guò)同源導(dǎo)向修復(fù)途徑進(jìn)行準(zhǔn)確地修復(fù)?；诂F(xiàn)有的同源DNA序列，同源導(dǎo)向修復(fù)途徑可以通過(guò)介導(dǎo)DNA序列交換過(guò)程，將提供的DNA序列作為修復(fù)序列插入到相匹配的斷裂DNA中，從而準(zhǔn)確修復(fù)DNA損傷。因而CRISPR/Cas9的敲除或敲入可通過(guò)誘導(dǎo)非同源末端連接或通過(guò)同源導(dǎo)向修復(fù)，刪除、替換或添加基因序列來(lái)實(shí)現(xiàn)[8]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在胰腺癌研究中被廣泛用于敲除與疾病進(jìn)展相關(guān)的基因。2018年Watanabe等[9]利用CRISPR/Cas9在人類(lèi)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系中敲除了KDM6A基因，從而證明了KDM6A缺乏的細(xì)胞系呈現(xiàn)出高侵襲性的表型。2018年P(guān)essolano等[10]及2016年Belvedere等[11]表明，在Mia PaCa2細(xì)胞系中利用CRISPR/Cas9定向敲除ANXA1基因，產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡分泌變少和運(yùn)動(dòng)減弱的表型。Barkeer等[12]研究團(tuán)隊(duì)在敲除Capan1細(xì)胞系中的GALNT3基因后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形成的微球體變少，并喪失了細(xì)胞自我更新、遷移的能力。2018年Chugh等[13]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將C1GALT1從PDAC細(xì)胞中敲除，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、成瘤、轉(zhuǎn)移、Tn 和sTn的表達(dá)增加。由此可見(jiàn)，敲除胰腺癌細(xì)胞特定基因相同策略的研究有很多，并且均觀察到了不同表型的變化?？偠灾@些研究表明，CRISPR/Cas9是一種非常強(qiáng)大的基因編輯工具，可以用來(lái)探索胰腺癌的基因信號(hào)通路、增殖、遷移、侵襲和潛在的化療耐藥。通過(guò)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除靶基因，觀察其產(chǎn)生的表型變化的特點(diǎn)，我們可以更好地了解靶基因的生物學(xué)功能，識(shí)別胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)或更好的治療策略。而要使CRISPR/Cas9技術(shù)成為一種有效的臨床治療策略，還有很長(zhǎng)的路要走。

近些年來(lái)，CRISPR/Cas9的基因敲除在探索腫瘤發(fā)生和發(fā)展方面也很重要，也常用于構(gòu)建特異性基因表達(dá)的干細(xì)胞和動(dòng)物模型，我們總結(jié)了2017-2019年的相關(guān)研究，見(jiàn)表1。盡管CRISPR/Cas9程序復(fù)雜，并且需要大量時(shí)間，但在胰腺癌的研究中，構(gòu)建基因表達(dá)載體，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒，將載體轉(zhuǎn)譯到細(xì)胞中從而生成特異性基因表達(dá)的細(xì)胞仍然很常見(jiàn)。

表1 使用CRISP/Cas9技術(shù)對(duì)胰腺腫瘤細(xì)胞基因敲除功能基因的研究相關(guān)

2.2 CRISPR在胰腺癌中的聯(lián)合文庫(kù)篩選 使用sgRNA(small guide RNA，sgRNA)文庫(kù)進(jìn)行功能缺失表型篩選是在特定生長(zhǎng)條件下識(shí)別蛋白質(zhì)新功能的一個(gè)有效方法。而CRISPR整合文庫(kù)篩選的主要策略則是在一個(gè)CRISPR整合文庫(kù)中包含數(shù)千個(gè)質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒帶有一個(gè)特定靶基因的sgRNA。首先sgRNA需要通過(guò)慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入足夠數(shù)量的細(xì)胞，將被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞放在特定條件下培養(yǎng)，以便篩選出所需的表型。篩選后，分離、提取出細(xì)胞中的基因組DNA，并進(jìn)行下一代測(cè)序。然后，將NGS數(shù)據(jù)映射到一個(gè)預(yù)編譯的庫(kù)中，其中包含基因特異性的gRNAs(guide RNAs，gRNAs)，并使用基于模型的全基因組CRISPR-Cas9敲除分析(model-based analysis of genome-wide CRISPR-Cas9 knockout，MAGeCK)等計(jì)算工具分析結(jié)果。最后，通過(guò)將對(duì)照組與所選gRNAs進(jìn)行對(duì)比，識(shí)別與所觀察到的表型相關(guān)的基因。

目前，已有一些研究在胰腺癌細(xì)胞中使用了CRISPR聯(lián)合文庫(kù)篩選。2019年，Bakke等[38]用人類(lèi)sgRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染PANC1-Cas9細(xì)胞，并利用100nM的吉西他濱條件培養(yǎng)細(xì)胞6 d以進(jìn)行篩選。在比較了吉西他濱選定樣本和對(duì)照樣組樣本的NGS結(jié)果后，PSMA6被確定為最佳靶點(diǎn)并繼續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制PSMA6可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和橢球體形成減少。2017年，Steinhart等[39]將TKO gRNA文庫(kù)導(dǎo)入HPAF-Ⅱ-Cas9細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)篩選細(xì)胞，以確定細(xì)胞增殖所需的基因群。他們利用BAGEL算法計(jì)算每個(gè)基因的對(duì)數(shù)拜耳因子(log Bayer factor， BF)。這一分析確定了Wnt信號(hào)通路的幾個(gè)核心成分，包括WLS、CTNNB1、TCF7L2、LRP5、PORCN，以及3個(gè)FZD受體，以及HPAF-Ⅱ增殖所必需的編碼基因FZD5、WNT7B、WNT10A。隨后，這些結(jié)果在AsPC-1和PaTU8988S細(xì)胞系中得到驗(yàn)證，并確定Wnt通路是胰腺癌細(xì)胞增殖的重要介質(zhì)。這些篩選的結(jié)果也表明, RNF43突變的PDAC細(xì)胞的生存、增殖均選擇性依賴(lài)Wnt-β-catenin信號(hào)。之后，在PATU8902和PATU8988T兩種細(xì)胞系中進(jìn)行了基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9敲除篩選，通過(guò)敲除以確定在MAPKi環(huán)境下能夠促進(jìn)增殖或生存的基因[40]。他們將GeCKOv2文庫(kù)轉(zhuǎn)入PATU8902細(xì)胞，將Avana文庫(kù)轉(zhuǎn)入PATU8988T細(xì)胞。使用100 nM 的MEK1/2抑制劑曲米替尼處理PATU8902細(xì)胞，使用10 nM的曲米替尼處理PATU8988T細(xì)胞。兩種細(xì)胞系在經(jīng)過(guò)14 d的處理之后，分離基因組DNA并進(jìn)行下一代測(cè)序。通過(guò)比較分析確定了CIC和ATXN1L，并通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)表明，CIC和ATXN1L的缺失均可降低曲美替尼治療的敏感性[41]。

這些研究成功地證明了在特定選擇條件下利用CRISPR聯(lián)合文庫(kù)篩選可以識(shí)別新的基因功能，從而為識(shí)別胰腺癌細(xì)胞的治療漏洞提供了一種非常強(qiáng)大的方法，并為新的治療策略指明了方向。但也有特殊因素會(huì)影響篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)文庫(kù)的大小不同，需要轉(zhuǎn)換不同數(shù)量的細(xì)胞來(lái)維持庫(kù)的覆蓋率。削弱選擇條件可能提供更全面的結(jié)果，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，而并不完全是由表型變化所引起。不同的選擇方法也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的可變性。深度測(cè)序質(zhì)量和數(shù)據(jù)分析工具的選擇也將在篩選準(zhǔn)確性方面發(fā)揮非常重要作用。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然需要使用正交方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 CRISPR/Cas9基因治療胰腺癌的現(xiàn)狀 在胰腺癌的基因治療方面，當(dāng)前的研究進(jìn)展包括基于基因的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的增敏、免疫接種和過(guò)繼免疫治療[42]。但近年來(lái)，由于其安全性和有效性，CRISPR/Cas9基因組編輯方法已在多個(gè)胰腺癌研究中得到應(yīng)用。CRISPR/Cas9基因治療在體內(nèi)、體外都有潛在的應(yīng)用前景。在體外治療中，細(xì)胞從體外分離并修飾，然后再移植回體內(nèi)。在體內(nèi)治療中，基因材料可以直接注入體內(nèi)。2015年Chiou等[43]通過(guò)逆行胰腺導(dǎo)管注射腺病毒Cre和慢病毒Cre載體建立了體內(nèi)胰腺癌模型，這項(xiàng)技術(shù)可以為胰腺癌的治療提供新的方法。因此，CRISPR/Cas9技術(shù)為單基因疾病、退行性疾病和HIV感染的治療帶來(lái)了巨大的希望，并且已經(jīng)進(jìn)行了多次CRISPR/Cas9的臨床試驗(yàn)。然而CRISPR/Cas9技術(shù)用于胰腺患者的治療仍有很長(zhǎng)的路要走，仍尚存一些問(wèn)題亟待解決，例如，哪個(gè)關(guān)鍵基因應(yīng)該作為靶標(biāo)?為了滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需要，其準(zhǔn)確性、效率和安全性如何提高？

CRISPR/Cas9不僅應(yīng)用于胰腺癌的研究，還被廣泛應(yīng)用于其他癌癥研究中，進(jìn)而加深了我們對(duì)疾病進(jìn)展的理解，耐藥機(jī)制的識(shí)別，并發(fā)現(xiàn)潛在的治療漏洞。然而，在臨床應(yīng)用CRISPR/Cas9之前，該技術(shù)仍有一些局限性需要認(rèn)清。潛在的脫靶效應(yīng)是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題，需要提高技術(shù)水平，盡量減少此類(lèi)狀況發(fā)生，以確保安全。目前，為減少偏離目標(biāo)的影響，諸多團(tuán)隊(duì)已經(jīng)作出了很大的努力。2013年，Ran等[44]將D10A突變的切口酶Cas9 (Cas9n)與一對(duì)與目標(biāo)位點(diǎn)相對(duì)鏈互補(bǔ)的偏置sgRna結(jié)合。該方法在不犧牲目標(biāo)切割效率的前提下，提高了CRISPR/Cas9編輯的特異性。2014年，Shen等[45]在小鼠成纖維細(xì)胞中，利用Cas9(D10A)、Cas9(H840A)進(jìn)行AR-A和AR-B基因編輯，并采用T7EN裂解法和TA克隆法檢測(cè)AR基因的修飾，未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。2014年Tsai等[46]證明二聚體RNA引導(dǎo)的FokI核酸酶(RNA-guided FokI Nucleases，RFNs)可以識(shí)別擴(kuò)展序列并高效編輯內(nèi)源基因。

綜上所述，針對(duì)當(dāng)前臨床對(duì)胰腺癌患者治療的現(xiàn)狀，CRISPR/Cas9正作為一種全新的工具和治療手段正在被逐漸開(kāi)發(fā)出來(lái)。在國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者的研究中有了一定的成果，為下一步的研究指出了潛在的方向。而當(dāng)前CRISPR/Cas9技術(shù)仍有一定的局限性，僅限于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，距離臨床應(yīng)用還有一定的距離，許多問(wèn)題都值得科研人員在后續(xù)的工作中去探討和完善。